李 靜,占建波，楊朝暉,雷亞克,張 婷,李國(guó)明

湖北2013年部分柯薩奇A16型腸道病毒VP1基因分子特征分析

李 靜,占建波，楊朝暉,雷亞克,張 婷,李國(guó)明

目的 全面研究和了解2013年湖北省柯薩奇A16型的VP1基因特征，分析CVA16型病毒在我省的基因型別及分子進(jìn)化分析。方法 對(duì)2013年湖北省21株CVA16病毒流行株進(jìn)行VP1區(qū)全長(zhǎng)基因序列測(cè)定，并對(duì)核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果 2013年湖北省21株CVA16型病毒流行株的VP1區(qū)核苷酸序列全長(zhǎng)均為891 bp，VP1區(qū)核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分別為90.0% ～ 100.0 % 和96.3% ～100.0%。VP1區(qū)基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，湖北CVA16流行株主要位于ligeage1和3分支上，分屬于B1a和B1b基因亞型。結(jié)論 2013年湖北省21株CVA16型流行株主要為B1b基因亞型，其次為B1a基因亞型，在同一地區(qū)有兩種基因亞型的 CVA 16 病毒同時(shí)存在, 在不同的地區(qū)存在同一種亞型的CVA16病毒。

柯薩奇病毒CVA16型；VP1區(qū)；基因特征

手足口病(Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)是由腸道病毒引起的傳染病，多發(fā)生于5歲以下兒童。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種(型)，以柯薩奇病毒A16型(CVA16)和腸道病毒71型(EV 71)最為常見(jiàn)[1]。雖然CVA16與EV71型病毒在遺傳上有一定的相似性，但CVA16具有自己的遺傳特性和分子生物學(xué)特征。CVA16引起的手足口病癥狀較輕，較少有并發(fā)癥發(fā)生，但CVA16和 EV 71的共同流行常會(huì)導(dǎo)致比較嚴(yán)重的手足口病疫情[2]。

本研究根據(jù)2013年湖北省部分地區(qū)HFMD病原學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果，對(duì)CA16型病毒進(jìn)行VP1基因序列測(cè)定和進(jìn)化分析，了解CA16型病毒在湖北省的主要型別以及分子流行病學(xué)特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 采自湖北省2013年手足口病監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院手足口病患兒的咽拭子、肛拭子、皰疹液標(biāo)本。

1.2 病毒核酸提取 對(duì)手足口病標(biāo)本病毒核酸直接進(jìn)行提取，核酸提取采用Qiagen公司的Viral RNA Mini Extraction Kit提取，具體步驟見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。提取的RNA溶于50 μL RNase-free ddH2O中，于-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CVA16病毒核酸陽(yáng)性的鑒定 對(duì)送檢標(biāo)本的核酸進(jìn)行real-time RT-PCR檢測(cè)，對(duì)CVA16病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行VP1基因擴(kuò)增。Real-time RT-PCR試劑盒購(gòu)自江蘇碩世生物科技有限公司。

1.4 CVA16病毒VP1基因引物設(shè)計(jì) 對(duì)CVA16病毒核酸real-time RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本直接進(jìn)行VP1基因擴(kuò)增，VP1基因上下游擴(kuò)增引物[3]分別為CVA16-VP1-S: 5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′ (nucleotides 2335 to 2354); CVA16-VP1-A: 5′-GCTGTCCTCCCACACAAGAT-3′ (nucleotides 3426 to 3445)。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1 100 bp。

1.5 CVA16病毒VP1基因RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序 采用one-step RT-PCR方法進(jìn)行VP1基因進(jìn)行擴(kuò)增。one-step RT-PCR Kit、Taq DNA聚合酶，dNTPs等均購(gòu)自Takara公司。VP1基因擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán), 最后72 ℃，7 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。所得PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行序列測(cè)定(由上海生工完成)。

1.6 CVA16病毒VP1基因同源性和進(jìn)化分析 將所測(cè)到的CVA16病毒的VP1序列與GenBank中其他CVA16病毒的VP1序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化分析。序列分析和進(jìn)化樹(shù)分析采用DNAStar MegAlign軟件和Mega5.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1 VP1基因核苷酸同源性分析 對(duì)湖北省21株CVA16型流行株進(jìn)行VP1基因核苷酸序列測(cè)定和分析。CVA16毒株VP1基因核苷酸序列長(zhǎng)度為891 bp，編碼297個(gè)氨基酸。利用DNAStar MegAlign軟件進(jìn)行VP1基因核苷酸和氨基酸序列比對(duì)分析。21株CVA16毒株的核苷酸與氨基酸序列同源性分別為90.0%～100.0%、96.3%～100.0%。21株毒株的VP1基因與A基因型代表株CVA16 G-10株VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性分別為75.3%～76.9%、88.9-92.6%, 與B基因型各亞型B1a、B1b、B1c和 B2株VP1區(qū)核苷酸同源性比較結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 湖北CVA16流行株與CVA16病毒不同基因型及亞型代表株VP1核苷酸與氨基酸同源性比較

Tab.1 Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence among CVA16 strains from Hubei and other different genotype (subgenotype) CVA16 strains on VP1 genes

▲CVA16 strains from Wuhan; △CVA16 strains from Shiyan; ■CVA16 strains from Huangshi; □CVA16 strains from Jingzhou; ○CVA16 strains from Xiantao; ●CVA16 strains from Xianning;◇CVA16 strains from Ezhou.

圖1 湖北CVA16流行株V P1全基因序列進(jìn)化分析

Fig.1 Phylogenetic analysis based on the alignment of the complete VP1 gene sequences of CVA16

2.2 CVA16毒株VP1基因分子進(jìn)化分析 利用Mega5.0 軟件， 運(yùn)用maximun-likelihood方法，根據(jù)CVA16病毒全長(zhǎng)VP1基因核苷酸序列進(jìn)行分子進(jìn)化分析。湖北CVA 16 流行株分別與lineage1和lineage3代表株處于一簇(見(jiàn)圖1)，且與B1a 和 B1b 亞型代表株分別處于同一分支上(見(jiàn)圖2)。21株CVA16毒株分別來(lái)自于武漢(WH)、鄂州(EZ)、咸寧(XN)、十堰(SY)、荊州(JZ)、黃石(HS)和仙桃(XT)。從進(jìn)化樹(shù)上可以發(fā)現(xiàn)，武漢、荊州和鄂州地區(qū)的CVA16毒株存在不同的基因譜系的CVA16毒株，以及不同基因亞型的CVA16毒株。

Fig.2 Phylogenetic and subgenotype analysis based on the VP1 gene sequences of CVA16 in Hubei Province, China

2.3 湖北CVA 16流行株的 V P1 區(qū)編碼蛋白變異位點(diǎn)分析 對(duì)21株湖北CVA16 流行株VP1區(qū)核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列與CVA16 病毒 A、B1a、B1 b、B1c 和 B2基因型及亞型代表株VP1區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，變異位點(diǎn)結(jié)果見(jiàn)表2。21株CVA16流行株與原型株 G 10之間的氨基酸變異位點(diǎn)進(jìn)行比較，其中JZ144-HB-2013株變異位點(diǎn)較多。在第 23位氨基酸位點(diǎn)處，9株CVA16流行株發(fā)生L→M的突變，與B1a亞型代表株馬來(lái)西亞MY823-3-SAR-97株(AM292443)一致。

3 討 論

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD) 是由腸道病毒引起的傳染病，引發(fā)HFMD的腸道病毒有20多種(型)，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)均為HFMD 較常見(jiàn)的病原體， 其中以柯薩奇病毒CVA16型和EV71最為常見(jiàn)[4]。CVA16病毒為單股正鏈RNA病毒，小RNA病毒科，腸道病毒屬成員。病毒為二十面體立體對(duì)稱球形結(jié)構(gòu)，病毒衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4 4種多肽組成，其中VP1、VP2和VP3位于衣殼表面，VP4位于病毒衣殼內(nèi)部。VP1區(qū)長(zhǎng)891bp，編碼297個(gè)氨基酸殘基，是病毒主要的中和抗原決定簇所在的部位，也是腸道病毒血清型的分型依據(jù)[5-6]。因此CVA16病毒VP1區(qū)核苷酸和氨基酸變異及分子進(jìn)化分析，有助于了解湖北省CVA16型病毒的分子流行病學(xué)特征。

本研究對(duì)湖北省21株CVA16型流行株進(jìn)行VP1基因核苷酸序列測(cè)定和分析，該21株CVA16毒株的VP1基因核苷酸與氨基酸序列同源性分別為90.0%～100.0%、96.3%～100.0%。與A基因型代表株CVA16 G-10株VP1區(qū)核苷酸和氨基酸同源性分別為75.3%～76.9%、88.9%～92.6%,與B基因型各亞型B1a、B1b、B1c和B2株VP1區(qū)核苷酸同源性分別為91.4%～95.8%，91.2%～97.0%，90.7%～92.9%，87.9%～91.1%；氨基酸同源性分別為96.0%～100.0%，95.6%～100.0%，95.3%～99.0%，96.3%～100.0%。根據(jù)核苷酸和氨基酸序列同源性分析結(jié)果，可以看到CVA16病毒VP1區(qū)核苷酸變異雖大，但氨基酸同源性較高，推測(cè)存在一定的同義突變。對(duì)CVA16病毒VP1區(qū)氨基酸序列變異位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，僅JZ144-HB-2013株變異位點(diǎn)較多。在第23位氨基酸位點(diǎn)處，有9株CVA16流行株發(fā)生L→M的突變，與B1a亞型代表株馬來(lái)西亞MY823-3-SAR-97株(AM292443)一致。

目前CVA16病毒基因分型主要有兩種方法，分別基于衣殼蛋白VP4區(qū)和VP1區(qū)核苷酸序列。Li等[7]根據(jù)CVA16病毒VP4核苷酸序列將CVA16分為A、B、C 三個(gè)分支。 Zhou等[8]根據(jù)VP1核苷酸序列對(duì)CVA16 病毒進(jìn)行分型分析，將CVA16分為A和B兩個(gè)基因型，其中B基因型有進(jìn)一步分為B1 (B1a和B1b)， B2以及B3基因亞型。主要為B1亞型，B1亞型又可以分為B1a和B1b兩個(gè)型別，B1a亞型主要為1999-2008年中國(guó)CVA16毒株，而B(niǎo)1b主要為2005-2006年的中國(guó)CVA16毒株，B2基因亞型主要為1999-2000年的中國(guó)CVA16毒株。根據(jù)進(jìn)化分析的Bootstrap值(99%)以及與B1和B2亞型核苷酸序列的9.0%～13.4%差異，劃分出B3基因亞型。Perera[9]等分析CVA16原型株G-10與其它所有CVA16毒株的VP1全基因核苷酸序列的差異為27.7%～30.2%，將G-10株劃分為A基因型。而其它所有CVA16 毒株VP1核苷酸差異均低于13.4%，因此將其它所有CVA16毒株劃分為B基因亞型。 其中B基因亞型的CVA16毒株根據(jù)Bootstrap值(>99%)進(jìn)一步分為兩個(gè)基因譜系lineages 1和2。根據(jù)CVA16病毒的基因型別之間VP1全基因序列的核苷酸差異至少為15%[9]，Zhang[3]等根據(jù)VP1核苷酸序列將中國(guó)CVA16毒株分為A和B兩個(gè)基因型，將B 基因型劃分為3個(gè)基因譜系lineage1、2和3，并根據(jù)核苷酸差異和進(jìn)化分析進(jìn)一步將B基因型分為B1和B2兩個(gè)基因亞型，B1亞型又分為B1a、B1b和B1c三個(gè)型別，其中B1a和B1b之間的核苷酸差異為6.5% ，B1c和B1a、B1c和B1b 之間的核苷酸差異分別為7.0% 和6.8%。Iwai[10]等將CVA16A、B和C三個(gè)型別，其中B和C分別相當(dāng)于Zhang等學(xué)者劃分的 B2和B1亞型。Zhang等研究表明，中國(guó)1999-2008年的CVA16毒株主要為B1a和B1b基因亞型，同一時(shí)期在臺(tái)灣、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、澳大利亞、越南以及沙特阿拉伯的CVA16毒株也分屬于B1a和B1b兩個(gè)基因亞型。這說(shuō)明中國(guó)的CVA16毒株與上述地區(qū)及國(guó)家流行CVA16毒株是共同進(jìn)化或流行。僅馬來(lái)西亞SB16087/MAL/2005)株單獨(dú)位于一個(gè)分支，形成B1c基因亞型。

Note:□The differences in amino acid sites

本研究根據(jù)Zhang等學(xué)者的分類方法，將湖北省21株CVA16毒株進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)湖北省CVA16毒株為B基因型，分別屬于lineage 1和3兩個(gè)基因譜系，基因型別分析分別為B1a和B1b基因亞型。在同一地區(qū)有兩種基因亞型的 CVA 16 病毒同時(shí)存在, 在不同的地區(qū)存在同一種亞型的CVA16病毒, 說(shuō)明湖北省CVA 16病毒的B1a與B1 b兩種基因亞型共同進(jìn)化與流行，主要流行的CVA 16 病毒為 B1b 基因亞型。

本研究對(duì)湖北省手足口病的 CVA 16流行株VP1基因進(jìn)行核苷酸變異和分子進(jìn)化分析, 了解湖北省CVA 16病毒的基因特征和流行情況, 為手足口病的防控提供了基礎(chǔ)資料。

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VP1 gene of Coxsackie virus A16 from Hubei Province, China, 2013

LI Jing,ZHAN Jian-bo,YANG Zhao-hui,LEI Ya-ke,ZHANG Ting,LI Guo-ming

(Hubei Center for Disease Control and Prevention, Wuhan 430079, China)

In order to investigate the genetic background of Coxsackie virus A16 (CVA16) in Hubei Province, China, the genetic characteristics of VP1 genes of CVA16 strains were analyzed in this study. The complete VP1 sequences of 21 CVA16 strains from clinical samples were amplified by one-step RT-PCR and sequenced to engage the homological and phylogenetic analysis. The full-length VP1 region of 21 CVA16 strains was 891 bp. The nucleotide and amino acid identity among the CVA16 strains were 90.0%-100.0% and 96.3%-100.0%, respectively. Phylogenetic analysis based on complete VP1 sequence also indicated that the 21 Hubei CVA16 strains were belonged to the lineage 1 and lineage 3 and further divided into subgenotype of B1a and B1b. The genotype of Hubei CVA16 strains were mainly B1b subgenotype followed by B1a subgenotype. In the same areas, two kinds of subgenotype of CVA16 co-existed and the same subgenotype CVA16 was prevalent in different areas in Hubei Province, China.

Coxsackie virus A16; VP1 gene; molecular characteristics

Li Guo-ming, Email:liguominghb@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.006

李國(guó)明，Email：liguominghb@163.com

湖北省疾病預(yù)防控制中心，武漢 430079

R373.2

A

1002-2694(2015)04-0320-05

2014-05-18；

2015-01-07

國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題(No.2012ZX10004207)

Supported by the Project of Pathogen Spectrum Research of Infectious Disease in Hubei Province (No. 2012ZX10004207-002)