脊柱結(jié)核基因診斷進(jìn)展

鐘志偉，黃艷，彭艷，武漢*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長春130033)

隨著HIV肆虐及免疫缺陷病患者的增加，全球結(jié)核發(fā)病有明顯上升趨勢，中國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[1]， 結(jié)核患者數(shù)居世界第2位，脊柱結(jié)核作為常見的繼發(fā)性肺外結(jié)核發(fā)病率也明顯增加。目前脊柱結(jié)核的診斷主要是根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像特征、實驗室檢查及診斷性治療情況進(jìn)行綜合診斷[2]，現(xiàn)行的實驗室診斷和耐藥性檢測及菌種鑒定方法遠(yuǎn)不能滿足脊柱結(jié)核早期診治的需求，迫切需要加強(qiáng)新技術(shù)的研究和應(yīng)用。近年來，基因診斷作為疾病診斷的研究熱點正逐步應(yīng)用于臨床，其對疾病診斷價值已得到廣泛認(rèn)同，本文將主要從常用脊柱結(jié)核基因診斷技術(shù)、基因診斷的優(yōu)缺點及相關(guān)研究進(jìn)展方面作一綜述。

基因診斷又稱DNA診斷，它是利用重組DNA技術(shù)，直接從基因水平檢測致病微生物的存在和種類，從而對臨床疾病作出診斷。1972年Goff SP和Berg P首次成功重組了世界上第一批DNA分子，標(biāo)志著基因檢測技術(shù)的誕生[3]。20世紀(jì)70年代中后期，由于PCR、基因芯片等技術(shù)的出現(xiàn)基因檢測得到了快速發(fā)展[4]。從病原學(xué)角度，基因診斷可應(yīng)用于各種病毒、細(xì)菌和寄生蟲病的檢測，隨著結(jié)核分枝桿菌全基因組測序工作的完成，結(jié)核疾病的診斷也進(jìn)入了基因時代，基因診斷技術(shù)在脊柱結(jié)核診斷領(lǐng)域的應(yīng)用已越來越被人們所認(rèn)識，它在病原體檢測、藥物選擇和療效評價等方面具有重要作用，必將為脊柱結(jié)核的防控和診治作出重大貢獻(xiàn)。

1常用脊柱結(jié)核基因診斷技術(shù)

脊柱結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌全身感染的局部表現(xiàn)，約占骨關(guān)節(jié)結(jié)核50%，好發(fā)于兒童和青少年[5]。以腰椎最為多見，胸椎次之，胸腰段占第三位，頸椎和骶椎較少見。其中，椎體結(jié)核約占99%、椎弓結(jié)核占1%左右。受累的脊柱表現(xiàn)有骨質(zhì)破壞及壞死，有干酪樣改變和膿腫形成，椎體因病變和承重而發(fā)生塌陷，嚴(yán)重者可造成癱瘓[6]。由于脊柱結(jié)核患者早期典型臨床特征不明顯，很容易造成誤診或者漏診，目前脊柱結(jié)核診斷仍以臨床癥狀結(jié)合X線、CT、MRI表現(xiàn)為主要診斷手段，尚缺乏敏感度高、特異性強(qiáng)的早期診斷指標(biāo)[7]。應(yīng)用基因診斷技術(shù)對脊柱結(jié)核的早期發(fā)現(xiàn)、脊柱結(jié)核患者的耐藥監(jiān)測、療效判斷等都具有較大的臨床使用價值和意義。目前常用的脊柱結(jié)核基因檢測技術(shù)主要有聚合酶鏈反應(yīng)( polymerase chain reaction， PCR)、基因芯片、核酸雜交等。

1.1　聚合酶鏈反應(yīng)( polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是指在體外由引物介導(dǎo)的DNA序列酶促合成反應(yīng)，即體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，包括變性、退火及延伸等幾步反應(yīng)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷[8]。Hance等[9]最先把PCR技術(shù)應(yīng)用到結(jié)核桿菌的診斷，擴(kuò)增出一383bp序列，編碼65kD分枝桿菌抗原，再用探針雜交，敏感度達(dá)到樣品細(xì)菌數(shù)少于100個即可被檢出的水平。對于骨關(guān)節(jié)結(jié)核基因診斷的報道始于1994年Lombard EH等[10]利用基因診斷技術(shù)檢測24名疑似骨結(jié)核病患者的骨髓液，其陽性率達(dá)到42%，明顯高于涂片抗酸染色法。隨后Sun Y等[11]也應(yīng)用PCR技術(shù)檢測60名骨結(jié)核病人骨髓液，陽性率為83%，發(fā)現(xiàn)基因檢測技術(shù)對診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核具有重要應(yīng)用價值。作為簡單有效的診斷方法，PCR技術(shù)在脊柱結(jié)核的診斷中已發(fā)揮了顯著作用。Li等[12]采用熒光定量PCR技術(shù)及抗酸染色法對208例結(jié)核病患者痰液中結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示兩種方法檢出陽性率分別為51.92%和25.96%， PCR法檢出的陽性率明顯高于抗酸染色法檢出的陽性率。同樣Portillo-Gomez等[13]運用不同方法檢測286例肺外結(jié)核病人腦脊液、胸膜液及腹水中結(jié)核分枝桿菌，發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)的特異性、敏感性最高。Bahram等[14]發(fā)現(xiàn)，通過多重實時定量PCR對不同管家基因的測定，可以快速準(zhǔn)確地鑒別結(jié)核分枝桿菌屬和非結(jié)核分枝桿菌屬，對臨床脊柱結(jié)核疾病診斷具有重要作用。此外，研究表明，MCP-1-2518 位點GG 基因型和G 等位基因均可能與脊柱結(jié)核的易感性相關(guān)，通過PCR技術(shù)檢測人群基因組DNA中MCP-1-2518 位點的G、A 等位基因的分布頻率[15]，可以預(yù)測患者罹患脊柱結(jié)核的風(fēng)險，從而對易感人群進(jìn)行預(yù)防性保護(hù)。

1.2　基因芯片

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因診斷在脊柱結(jié)核診斷中作用日益明顯，而基因芯片技術(shù)的發(fā)展成為脊柱結(jié)核耐藥基因診斷的一個新里程碑，基因芯片是通過微陣列技術(shù)將大量的DNA片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可獲得樣品的遺傳信息[16]，是伴隨“人類基因組計劃”的研究進(jìn)展而快速發(fā)展起來的一門高新技術(shù)。Zhang等[17]最先將基因芯片用于脊柱結(jié)核診斷，研究表明在對153名脊柱結(jié)核患者利福平及異煙肼耐藥檢測中，CapitalBio? 基因芯片靈敏度達(dá)到93.55%?，檢測過程平均用時僅5.8小時，具有高通量檢測、靈敏準(zhǔn)確、高效快速等優(yōu)點。隨著結(jié)核病疫情不斷惡化，脊柱結(jié)核發(fā)病率及復(fù)發(fā)率亦逐年增加，耐藥結(jié)核、耐多藥結(jié)核甚至廣泛耐藥結(jié)核的流行是主要原因之一[18]。通過基因芯片技術(shù)診斷耐藥脊柱結(jié)核，可有效控制患者復(fù)發(fā)率。近年生物技術(shù)不斷發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因及相關(guān)位點突變不斷被分析鑒定[19]，通過對相關(guān)耐藥基因設(shè)計芯片進(jìn)行檢測，即可判斷脊柱結(jié)核患者耐藥情況，為患者選擇有效藥物治療方案提供依據(jù)，也是治愈結(jié)核病、控制結(jié)核病流行的前提[20]。例如利福平耐藥相關(guān)基因主要為rpoB[21]，Gingeras等[22]利用rpoB基因保守區(qū)705bp的核苷酸探針，對44株結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥分離株進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)了40株存在rpoB基因的突變，突變檢出率為90.9%，表明基因芯片用于結(jié)核耐藥檢測的敏感性、特異性均較高，且檢測結(jié)果與基因測序完全一致[23]，為后期患者進(jìn)一步治療提供參考。近年來國內(nèi)外學(xué)者的研究已初步證實，基因芯片技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥檢測具有高度的準(zhǔn)確性[24]，而且基因芯片耐藥檢測是基于DNA片段的檢測，安全性高，開展性廣。

1.3　核酸雜交

核酸雜交是指用標(biāo)記的已知DNA或RNA片段(探針)來檢測樣品中未知核酸序列(形成異源雙螺旋)，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核苷酸序列的位置或大小顯示出來。結(jié)核分枝桿菌基因組中含有特異的高度重復(fù)序列，將這些重復(fù)序列作為靶基因，用核酸雜交和PCR等技術(shù)對脊柱結(jié)核患者進(jìn)行特異性檢測就可達(dá)到基因診斷的目的[25]。目前主要核酸雜交技術(shù)包括膜上印跡雜交、斑點雜交、原位雜交。這些方法在臨床診斷中都已得到應(yīng)用，與脊柱結(jié)核的疾病診斷也密切相關(guān)[26]。LIANG等[27]采用反向斑點雜交技術(shù)分析鑒定37例脊柱結(jié)核術(shù)后患者病理組織或膿液抗酸染色陽性標(biāo)本的分枝桿菌菌種，結(jié)果表明與傳統(tǒng)診斷方法相比，核酸雜交技術(shù)可快速高效準(zhǔn)確地鑒定脊柱結(jié)核分枝桿菌菌種，降低誤診漏診率，同時為脊柱結(jié)核患者有效治療爭取了時間。核酸雜交技術(shù)簡便、快速、靈敏，CHEN等[28]研究發(fā)現(xiàn)膜反向斑點雜交技術(shù)可以直接檢測結(jié)核分枝桿菌katG、rpoB 基因突變，為臨床檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥性提供輔助診斷手段，同時也為該技術(shù)的進(jìn)一步推廣，應(yīng)用于其它的病原微生物及基因突變檢測領(lǐng)域奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。

目前的研究[29]表明，與傳統(tǒng)藥物敏感性檢測方法相比，核酸雜交技術(shù)可在臨床結(jié)核桿菌快速耐藥檢測中一次性對多種耐藥基因的多種基因位點進(jìn)行快速基因型鑒定，具有檢測信息量大的特點，臨床應(yīng)用前景極大[30]。

2基因診斷的優(yōu)缺點及展望

2000年人類基因組草圖的公布，標(biāo)志著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展已進(jìn)入“基因組醫(yī)學(xué)”時代[31]?；蛟\斷技術(shù)雖然僅短短20多年歷史，但發(fā)展迅速，在臨床診治中得到廣泛應(yīng)用。目前對于脊柱結(jié)核的實驗室診斷主要依據(jù)細(xì)菌學(xué)檢查，雖然細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但其培養(yǎng)周期長、繁瑣費時、影響因素多，不能作為快速診斷方法。與之相比，基因診斷具有很突出的優(yōu)點，主要包括：第一特異性高，通過選用特異性高的分子探針作為工具，可有針對性的檢測樣本特異表達(dá)基因的差異情況。第二靈敏度高，通過PCR技術(shù)，將檢測的信號不斷放大，即使是微量的樣品也能得出精確的結(jié)果。第三穩(wěn)定性和重復(fù)性好。第四，早期快速診斷性，只要外源基因進(jìn)入或者基因發(fā)生變化，不管處于何種時期，都可以有效診斷，而且用時短，操作方便[32]?；蛟\斷的臨床價值是值得肯定的，但近年來的臨床實踐也證明其仍具有一定的局限性。首先針對PCR技術(shù)缺點主要表現(xiàn)在假陽性[33]。PCR的敏感性極高,微量的污染即可導(dǎo)致假陽性的發(fā)生，這是PCR技術(shù)假陽性發(fā)生的最主要原因。所以在標(biāo)本收集至整個操作過程中的各個環(huán)節(jié)必須保證嚴(yán)格的“無菌操作”，以避免污染；同時提高引物特異性也是避免假陽性發(fā)生的關(guān)鍵。而基因芯片雖然在結(jié)核耐藥診斷研究中意義重大，但由于目前基因芯片技術(shù)尚不夠完善，還在不斷發(fā)展，特別是其價格昂貴、對操作的要求較高、重復(fù)性差等使其應(yīng)用范圍受到很大限制，這些問題主要需從樣品的制備、探針合成固定、分子的標(biāo)記等方面著手解決。

脊柱結(jié)核早期診斷可以有效預(yù)防患者并發(fā)癥的出現(xiàn)，對于我國來說，面對結(jié)核病死灰復(fù)燃、脊柱結(jié)核病例逐年攀升的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，對脊柱結(jié)核病的預(yù)防和早期診斷是一項非常值得探討的重大課題?；蛟\斷作為新興疾病診斷技術(shù)，近年來取得了重大進(jìn)展，包括PCR、基因芯片以及核酸雜交等技術(shù)比傳統(tǒng)方法更特異、敏感、快速，對臨床鑒定及流行病學(xué)研究都產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。但是，由于技術(shù)上的難點和高昂的成本，基因診斷還存在著諸多缺點有待進(jìn)一步解決和提高。客觀地講,限于目前的技術(shù)水平,基因診斷方法還不能完全替代常規(guī)診斷手段,它只是作為常規(guī)診斷的輔助方法。但隨著基因組計劃的深入開展和科技的不斷發(fā)展，基因診斷技術(shù)將會更加完善并在臨床上逐步得到普及。

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收稿日期：(2014-08-18)

作者簡介：鐘志偉(1986-)，男，碩士研究生，研究方向：脊柱外科；武漢(1967-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師。

文章編號：1007-4287(2015)01-0165-04

通訊作者*

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(編號：30772209)