李海龍，畢曉瑩

微小核糖核酸（micro ribonucleic acids，miRNAs）作為一種小分子（約22個(gè)核苷酸）非編碼核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），主要在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達(dá)，盡管這種調(diào)節(jié)機(jī)制還未被完全闡明，但目前初步認(rèn)為它主要通過(guò)與目標(biāo)信使RNA（messager RNA，mRNA）3’端未翻譯的區(qū)域完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ)地緊密配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而使目標(biāo)mRNA退化或者抑制其下一步的翻譯[1]。有研究通過(guò)閉塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈模擬短暫腦缺血，發(fā)現(xiàn)腦組織和血液均有特異性miRNAs的高表達(dá)[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在同樣的模型中，短暫閉塞大腦中動(dòng)脈及永久閉塞大腦中動(dòng)脈的大鼠血漿中miR-124濃度在干預(yù)后8 h開始升高，24 h達(dá)高峰，與假手術(shù)組相比升高近150倍，意味著組織損傷特異性的miRNAs可被用來(lái)作為缺血性卒中的敏感生物學(xué)標(biāo)記物[3]。而利用miRNAs這種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的特性，通過(guò)某種傳遞系統(tǒng)減少引起病理?yè)p害和異?；虮磉_(dá)的miRNAs，提高發(fā)揮有益功能的miRNAs水平，可用于包括缺血性卒中等缺血性疾病的治療[4]。本文對(duì)缺血性卒中的病因、診斷、治療、預(yù)后等方面中近些年來(lái)有關(guān)miRNAs的研究進(jìn)展做一綜述，為miRNAs接下來(lái)在臨床上的實(shí)踐應(yīng)用研究提供依據(jù)。

1 miRNAs在缺血性卒中高危因素中的作用

缺血性卒中的發(fā)生與多種致病因素有關(guān)，最常見的原因是頭部或頸部的動(dòng)脈血管進(jìn)行性狹窄，這種血管狹窄常由動(dòng)脈粥樣硬化造成[5]。高脂肪飲食所導(dǎo)致的低密度脂蛋白、膽固醇、甘油三酯水平升高是動(dòng)脈粥樣硬化具有顯著意義的危險(xiǎn)因素。當(dāng)腦動(dòng)脈血管過(guò)于狹窄，血細(xì)胞便可聚集并形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。這些斑塊可以在其形成的部位直接阻斷動(dòng)脈血管或者脫落后在下游較小的腦動(dòng)脈處阻塞血管。

組織特異性是miRNAs表達(dá)的一個(gè)重要特征[6]。有研究對(duì)大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)行miRNAs微陣列芯片分析，在180個(gè)miRNAs陣列中，正常的大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈中發(fā)現(xiàn)了140個(gè)，其中有49個(gè)miRNAs高度表達(dá)[7]。血管內(nèi)切應(yīng)力損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而引起脂質(zhì)沉積是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要機(jī)制。眾多研究已證實(shí)，血管內(nèi)切應(yīng)力決定動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)生于血管分叉及彎曲處[8]。有研究報(bào)道，血管內(nèi)切應(yīng)力可誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生miR-21，在內(nèi)皮細(xì)胞中，高表達(dá)的miR-21可抑制凋亡基因磷酸酶基因，增強(qiáng)蘇氨酸激酶及一氧化氮合成酶的磷酸化，增加一氧化氮（nitric oxide，NO）的產(chǎn)生，從而防止內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[9]。miRNAs還參與阻止白細(xì)胞的黏附聚集，血管細(xì)胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）是由被炎癥因子激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞間黏附分子，可通過(guò)與白細(xì)胞基本表達(dá)的α4β1-整合素蛋白相結(jié)合黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，miR-126表達(dá)的減少可引起VCAM-1的表達(dá)增高，且靜息狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞正常表達(dá)miR-126[10]，提示miR-126的表達(dá)可抑制VCAM-1，進(jìn)而阻止白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并可能具有抗炎作用。

高脂血癥已被證實(shí)是腦血流低灌注和缺血性卒中的重要危險(xiǎn)因素。最近的有關(guān)miRNAs在調(diào)節(jié)膽固醇平衡方面的研究顯示，在人類和大鼠的細(xì)胞中，miR-33可抑制三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子（adenosinetriphosphate-binding cassette transporter，ABCA1）的表達(dá)從而減緩膽固醇流向載脂蛋白，因此，在巨噬細(xì)胞中，miR-33的高表達(dá)和拮抗作用可明顯改變膽固醇的流向，這在過(guò)量的膽固醇逆途徑運(yùn)輸回肝臟的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[11]。在粥樣斑塊的脂質(zhì)核心形成過(guò)程中，miRNAs調(diào)節(jié)粥樣斑塊相關(guān)的巨噬細(xì)胞攝取低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）從而轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在被氧化型LDL刺激后的巨噬細(xì)胞中，miR-125a-5p可介導(dǎo)其對(duì)脂質(zhì)的攝取并減少一些炎癥因子的分泌釋放（諸如白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β）[12]，因此，miR-125a-5p的上述作用可能在防止動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中發(fā)揮重要保護(hù)作用。

高血壓病是缺血性卒中的一項(xiàng)顯著危險(xiǎn)因素，miRNAs直接參與血管緊張素Ⅱ型1受體基因多態(tài)性增強(qiáng)血管緊張素1受體活性的機(jī)制并與血壓升高相關(guān)聯(lián)[13]。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)人類的主要血管平滑肌細(xì)胞使用抑制轉(zhuǎn)錄的miR-155抑制劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，內(nèi)源性的人血管緊張素Ⅱ型1受體的表達(dá)和血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated proteinkinases，ERK）活性均顯著升高[14]。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，成年高血壓大鼠與正常大鼠相比，主動(dòng)脈中的miR-155表達(dá)減少，且與血壓的水平呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈中miR-208的表達(dá)程度與血壓和年齡均呈負(fù)相關(guān)[15]，這表明miR-155很可能參與了高血壓病的發(fā)展及其病理過(guò)程。

2 miRNAs作為缺血性卒中診斷性生物學(xué)標(biāo)記物的研究

目前，卒中的診斷和分型主要依賴于臨床醫(yī)師的物理檢查并輔以多種影像學(xué)檢查技術(shù)作為補(bǔ)充，與急性冠狀動(dòng)脈綜合征中可檢測(cè)肌鈣蛋白、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶作為診斷性生物學(xué)標(biāo)記物不同，由于缺乏快速性、精確性和敏感性的生物學(xué)標(biāo)記物的檢測(cè)機(jī)制，暫無(wú)應(yīng)用于臨床的卒中相關(guān)血漿生物學(xué)標(biāo)記物。來(lái)源于各種組織和器官的血漿miRNAs具有很好的穩(wěn)定性并且可耐受核酸酶的消化和其他惡劣環(huán)境，比如煮沸、過(guò)高或過(guò)低的PH值、長(zhǎng)期的存放以及冰凍-融化循環(huán)[16]。威斯康星大學(xué)的Dharap等[17]對(duì)大鼠短暫大腦中動(dòng)脈阻斷恢復(fù)再灌注后在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定miRNAs以了解其功能作用，在恢復(fù)灌注后3 h到3 d的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，與假手術(shù)組相比，所估測(cè)的238種miRNAs中有8種表達(dá)增多，12種表達(dá)減少，且發(fā)生變化的miRNAs與多種介導(dǎo)炎癥、神經(jīng)保護(hù)、受體功能和離子平衡的mRNA相關(guān)，而加利福尼亞大學(xué)的Da-Zhi Liu等[18]對(duì)缺血性卒中、腦出血和紅海藻鹽癲癇的大鼠模型造模24 h后測(cè)定腦組織和全血中的miRNAs顯示，至少在一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，?種miRNAs在腦組織和全血中同時(shí)上調(diào)，4種miRNAs同時(shí)下調(diào)，更為顯著的發(fā)現(xiàn)是miR-298是所有模型造模后唯一在腦組織和血液中均有上調(diào)的miRNAs，這與之前的研究中發(fā)現(xiàn)短暫大腦中動(dòng)脈阻斷后腦組織和血液中miR-298同時(shí)上調(diào)的結(jié)果一致[2]。這表明血漿miRNAs可能成為用來(lái)診斷卒中的一種具有較高敏感性和特異性的血漿生物學(xué)標(biāo)記物。

有研究得出結(jié)論，在年輕卒中患者中，miRNAs的表達(dá)明顯受卒中的影響，其表達(dá)在卒中病變動(dòng)脈的大小、卒中類型以及不同的預(yù)后結(jié)局均不同[19]。一項(xiàng)意在尋找腦梗死中腦組織特異性的miRNAs作為可能生物學(xué)標(biāo)記物的研究發(fā)現(xiàn)，在大腦和小腦中分別檢測(cè)到了389和395種miRNAs，其中有13種miRNAs的表達(dá)具有腦組織特異性，對(duì)該miRNAs陣列中信號(hào)最強(qiáng)的三種miRNAs進(jìn)一步分析后顯示，miR-124幾乎在僅在腦組織中表達(dá)，在大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occasion，MCAO）大鼠模型中，血漿miR-124濃度在造模后6 h明顯升高，并且在48 h仍有升高，而作為對(duì)照的假手術(shù)大鼠中miR-124濃度一直在初測(cè)值的下限，線性回歸分析顯示大鼠腦梗死面積與血漿miR-124濃度無(wú)關(guān)聯(lián)，因此，miR-124有可是腦梗死的一種生物學(xué)標(biāo)記物[20]。另一項(xiàng)以miR-210作為急性缺血性卒中生物學(xué)標(biāo)記物的研究顯示，與正常健康對(duì)照人群相比，急性缺血性卒中患者血液中的miR-210明顯減少，特別是在卒中發(fā)生后的7 d和14 d，而且，在卒中患者中，預(yù)后較好人群的miRNA-210水平高于預(yù)后較差的人群。在該研究隨后的動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，miR-210在血液和腦組織中的水平呈正相關(guān)。以上研究提示，血液miR-210可能是急性缺血卒中診斷和預(yù)后判斷的一種全新的敏感性生物學(xué)標(biāo)記物[21]。此外，血液循環(huán)中miR-145也被發(fā)現(xiàn)在缺血性卒中的患者中較對(duì)照人群有顯著的升高，同樣也值得作為生物學(xué)標(biāo)記物去更深入地研究[22]。如能發(fā)現(xiàn)一種或多種血漿生物學(xué)標(biāo)記物，通過(guò)在緊急狀態(tài)下檢測(cè)這種標(biāo)記物便可對(duì)卒中進(jìn)行診斷、分型甚至預(yù)測(cè)再發(fā)，這將具有極其重要的價(jià)值。

3 miRNAs在缺血性卒中治療中的研究進(jìn)展

缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic pre-conditioning，IPC）是以不足以引起大腦缺血損傷所介導(dǎo)的細(xì)胞途徑，這種途徑可減少隨后缺血性損傷對(duì)腦組織的損害[23]。缺血性卒中發(fā)生時(shí)有miRNAs表達(dá)的變化，一些miRNAs可能具有一定神經(jīng)保護(hù)作用，而對(duì)IPC的分析研究可直接揭示miRNAs在神經(jīng)保護(hù)中的作用，進(jìn)而為尋找缺血性卒中患者新的治療方法提供可能。在一項(xiàng)以IPC與缺血性卒中發(fā)生后miRNAs變化作對(duì)照的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-200和miR-182兩大miRNAs家族在腦缺血預(yù)適應(yīng)后3 h選擇性地上調(diào)，體外試驗(yàn)顯示，將8種在體實(shí)驗(yàn)中選擇性上調(diào)的miRNAs轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞中后，該細(xì)胞的生存能力較對(duì)照組增強(qiáng)，提示這些miRNAs具有神經(jīng)保護(hù)作用，其中具有最大神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的miR-200b、miR-200c和miR-429通過(guò)下調(diào)脯氨酰羥化酶-2（prolyl hydroxylase 2）水平發(fā)揮作用[24]。另一項(xiàng)關(guān)于小鼠短暫缺血預(yù)適應(yīng)模型中miRNAs變化及作用靶點(diǎn)的研究顯示，缺血預(yù)適應(yīng)組的miRNAs表達(dá)與假手術(shù)組、缺血性卒中組及耐受組有差異，預(yù)適應(yīng)所調(diào)節(jié)的miRNAs主要作用于甲基CpG結(jié)合蛋白2（methyl-CpGbinding protein 2，MeCP2）mRNA，而缺血預(yù)適應(yīng)通過(guò)減少miR-132表達(dá)的同時(shí)增加甲基CpG結(jié)合蛋白2蛋白，但卻對(duì)MeCP2 mRNA水平無(wú)影響，敲除MeCP2的小鼠對(duì)缺血極為敏感，提示miRNA和MeCP2可成為缺血預(yù)適應(yīng)介導(dǎo)的缺血耐受的效應(yīng)物[25]。此外，國(guó)內(nèi)首都醫(yī)科大學(xué)的一項(xiàng)研究對(duì)miRNAs在缺氧預(yù)適應(yīng)（hypoxic pre-conditioning，HPC）及MCAO小鼠造模后6 h的表達(dá)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，有19種miRNAs通過(guò)一系列重要的調(diào)節(jié)途徑（檸檬酸循環(huán)、糖酵解途徑、氧化磷酸化途徑等）對(duì)蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）βII、PKCγ和新型PKCε相互作用蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)，而這幾種PKC亞型已被證實(shí)參與HPC介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用，其中下調(diào)miR-615-3p水平可通過(guò)調(diào)節(jié)一種被稱作14-3-3γ的蛋白在HPC介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮重要作用[26]。這些研究有助于更好地理解缺血缺氧預(yù)適應(yīng)所介導(dǎo)的耐受機(jī)制，尋找新的臨床治療靶點(diǎn)，為缺血性卒中的治療及預(yù)防提供新的策略。

有關(guān)miRNAs在缺血性卒中潛在治療效應(yīng)的一系列研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)上調(diào)或抑制一些miRNAs的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)mRNA翻譯表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)，可起到神經(jīng)保護(hù)及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在體外試驗(yàn)中，暴露于缺血缺氧環(huán)境后，神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞miRNAs的表達(dá)種類及隨時(shí)間變化各不相同，因此，miRNAs的這種在腦組織缺血后時(shí)間性和空間性的表達(dá)模式值得更進(jìn)一步的研究，并有助于促使新的治療干預(yù)措施被發(fā)現(xiàn)[27]。新加坡國(guó)立大學(xué)的Sepramaniam等[28]對(duì)MCAO大鼠模型中斷1 h供血模擬缺血性卒中，隨即給予側(cè)腦室注射miR-320a抑制劑及miR-320a前體，并對(duì)水分子通道蛋白-1（aquaporin 1，AQP-1）和AQP-4的表達(dá)以及腦組織梗死區(qū)大小進(jìn)行測(cè)定，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-320a可直接作用于AQP-1和AQP-4的mRNA并可影響缺血條件下AQP-1和AQP-4表達(dá)，其中miR-320a前體起抑制作用，而miR-320a抑制劑表現(xiàn)為激活作用，且可明顯減少缺血性卒中后的梗死區(qū)面積，提示miR-320a可作為缺血性卒中的潛在治療靶點(diǎn)。其另一項(xiàng)有關(guān)miRNAs調(diào)節(jié)水通道蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a、miR-152、miR-668、miR-939和miR-1280在缺血性卒中星形膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)且可調(diào)節(jié)AQP-4M1亞型啟動(dòng)子活性，而miR-130a被認(rèn)為是AQP-4M1亞型的翻譯表達(dá)抑制劑，在體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，miR-130a抑制劑可上調(diào)AQP-4M1亞型mRNA轉(zhuǎn)錄活性及其蛋白產(chǎn)物，并縮小腦梗死區(qū)面積促進(jìn)梗死的恢復(fù)[29]。有關(guān)miRNAs神經(jīng)保護(hù)作用的研究還發(fā)現(xiàn)，在體實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中，miR-223可調(diào)節(jié)羥甲基惡唑丙酸受體亞型GluR2和天門冬氨酸受體（N Methyl D aspartate receptor，NMDAR）亞型NR2B的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)NMDA介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元中的鈣離子內(nèi)流和興奮性毒性作用，miR-223不足可引起高水平表達(dá)的GluR2和NR2B，促進(jìn)NMDA介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，增加海馬神經(jīng)元的微小興奮性突觸后電位的產(chǎn)生[30]，這表明miR-233的這種神經(jīng)保護(hù)特點(diǎn)可能成為缺血性卒中的新的治療方法。與miR-233的這種保護(hù)作用不同的是，miR-181參與加重缺血性卒中的腦損傷，在小鼠MCAO模型再灌注早期，mi-181水平升高的損傷區(qū)域常注定會(huì)壞死，而mi-181減少的區(qū)域有被挽救的可能，該研究證實(shí)，miR-181可能通過(guò)抑制一種具有細(xì)胞保護(hù)作用的分子伴侶——葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein，GRP78）的表達(dá)加重神經(jīng)損傷，減少或阻止miR-181的表達(dá)可能具有保護(hù)腦功能的作用[31]。

這一系列體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果均提示，miRNA在調(diào)節(jié)缺血性卒中發(fā)生后神經(jīng)細(xì)胞死亡的一些途徑中具有關(guān)鍵作用，通過(guò)控制miRNA的表達(dá)水平來(lái)對(duì)缺血性損傷進(jìn)行干預(yù)可能成為未來(lái)卒中治療的一項(xiàng)新的治療方法。

4 總結(jié)與展望

目前，通過(guò)成熟的動(dòng)物模型和分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，很多miRNAs在缺血性卒中中的作用和功能已被有效地認(rèn)識(shí)和識(shí)別[32]，同時(shí)miRNAs還參與了缺血性卒中的眾多危險(xiǎn)因素的發(fā)生與形成，循環(huán)血中miRNAs較好的理化穩(wěn)定性使其有理由成為一種可靠的非侵入性的臨床生物學(xué)標(biāo)志物，其通過(guò)抑制mRNA的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)多種重要蛋白表達(dá)的特點(diǎn)為缺血及再灌注的腦損傷治療提供了新的方法對(duì)策?，F(xiàn)階段，大多數(shù)有關(guān)miRNAs和卒中的相關(guān)研究還主要集中在動(dòng)物卒中模型和體外試驗(yàn)中，有關(guān)miRNAs的診斷和治療作用的臨床實(shí)驗(yàn)研究期望在不久的將來(lái)得到有效地開展。

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