胡金靈　邵世飚　梁廷波

·實(shí)驗(yàn)研究·

脂肪干細(xì)胞提取方法的改良

胡金靈邵世飚梁廷波

目的 探索一種簡單高效的脂肪干細(xì)胞提取方法。方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取SD大鼠，在傳統(tǒng)脂肪干細(xì)胞提取方法的基礎(chǔ)上提高膠原酶濃度并省略裂解紅細(xì)胞及篩網(wǎng)濾過步驟作改良，比較兩種提取方法所用時(shí)間、提取的脂肪干細(xì)胞數(shù)量、生物學(xué)特性、傳代及分化能力等。結(jié)果 改良法提取脂肪干細(xì)胞用時(shí)70min，提取5瓶原代細(xì)胞，未污染，細(xì)胞3d后傳代，子代細(xì)胞生長良好，成功誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。結(jié)論 改良法提取脂肪干細(xì)胞能夠顯著增加細(xì)胞提取數(shù)量，縮短提取時(shí)間，降低原代細(xì)胞污染率，不影響細(xì)胞生物學(xué)特性及分化能力，是一種簡單高效的脂肪干細(xì)胞提取方法。

脂肪干細(xì)胞 改良 提取

各種急慢性肝病已經(jīng)成為危害人類健康的重要疾病，目前世界上對(duì)于肝病的治療主要采取維持和支持療法，肝移植因供體的缺乏、費(fèi)用昂貴以及尚存在免疫排斥等問題尚未解決。近年來，人們發(fā)現(xiàn)脂肪組織中含有一種多功能干細(xì)胞，即脂肪干細(xì)胞（adiposederived stem cells ADSCs），它不僅在細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞衰老、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和橫向分化能力等方面與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchmal stem cells MSCs）非常相似，且還具有來源廣泛，容易大量獲得，取材方便，給患者帶來的痛苦小等優(yōu)點(diǎn)［1～3］。作者自2010年8月至2013年8月在脂肪干細(xì)胞提取過程中，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)和不斷改進(jìn)，摸索出一種比較理想的提取方法，現(xiàn)介紹如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 成年SD大鼠，雌雄不限，200g左右，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。Ⅰ型膠原酶、油紅O、胰島素、地塞米松、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤均購自美國Sigma公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。基礎(chǔ)培基：DMEM+10%FBS+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素，誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素+10μg/ml胰島素+1μmoL/L地塞米松+0.5mmoL/L異丁基甲基黃嘌呤+200μmoL /L吲哚美辛。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 （1）脂肪碎片制備：動(dòng)物稱重后，水合氯醛過量麻醉處死，無菌條件下取出腹股溝處脂肪墊，盡量剔除軟組織和小血管，PBS緩沖液沖洗3～5次。將脂肪組織剪成小塊，PBS緩沖液反復(fù)沖洗，制備兩等份脂肪組織碎片。（2）脂肪干細(xì)胞傳統(tǒng)提法：將上述一份脂肪組織碎片在37℃下由0.075%I型膠原酶消化60min，含10%FBS的DMEM 等體積中和，1000轉(zhuǎn)/min離心10min后棄去上清液，160mmol/L NH4Cl裂解紅細(xì)胞10min，離心棄去上清液，含10%FBS的DMEM重懸細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過濾后離心，基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后分別接種至3只培養(yǎng)瓶。48h后第一次換液，此后每3d更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時(shí)傳代，37℃下0.25%胰酶消化，離心棄上清液，基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液1：2接種至培養(yǎng)瓶，每3d更換培養(yǎng)基。（3）脂肪干細(xì)胞改良提法：將上述另一份脂肪組織碎片在37℃下由0.25%I型膠原酶消化30min（消化開始，計(jì)時(shí)器開始計(jì)時(shí)），含10%FBS的DMEM等體積中和，1000轉(zhuǎn)/min離心10min后棄去上清液，基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后分別接種至5只培養(yǎng)瓶（計(jì)時(shí)器停止計(jì)時(shí)）。48h后換液，除去未貼壁細(xì)胞，此后每天更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長至亞融合狀態(tài)時(shí)傳代，37℃下0.25%胰酶消化，離心棄上清液，基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液1：2接種至培養(yǎng)瓶，每3d更換培養(yǎng)基。（4）細(xì)胞提取后處理：定時(shí)在倒置相差顯微鏡下觀察兩種方法提取的原代干細(xì)胞及子代干細(xì)胞，并拍照記錄。（5）脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)：子二代細(xì)胞長至亞融合狀態(tài)時(shí)，37℃下0.25%胰酶消化，離心棄上清液，基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，行細(xì)胞爬片，2d后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3d更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)后1周行油紅O染色。

2　結(jié)果

2.1從計(jì)時(shí)開始，傳統(tǒng)方法提取脂肪干細(xì)胞用時(shí)128min，新方法提取干細(xì)胞用時(shí)70min，新方法較傳統(tǒng)法縮短58min。

2.2傳統(tǒng)方法提取的3瓶原代ADSCs，1瓶污染（培養(yǎng)液混濁，見大量細(xì)菌生長），2瓶未見污染，污染百分比33.3%；改良法提取的5瓶原代ADSCs均未污染，污染百分比為0%。

2.3未污染原代ADSCs的生物特性 細(xì)胞接種4～6h后鏡下可見少量呈圓形或類圓形的細(xì)胞開始貼壁，24h后干細(xì)胞大多已貼壁，并開始伸展，多呈梭形，胞質(zhì)中可見脂滴。48h后貼壁細(xì)胞開始分裂增殖，多呈成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞匯合成單層，排列出現(xiàn)方向性。

2.4脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)及傳代情況 鏡下可見每瓶改良方法提取的原代脂肪干細(xì)胞數(shù)量均明顯多于每瓶傳統(tǒng)方法提取的原代脂肪干細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)液中的雜質(zhì)也是新方法中的較多，隨著換液和傳代，視野中的雜質(zhì)逐漸減少。改良方法提取的原代干細(xì)胞3d后長至亞融合狀態(tài)，可傳代，而傳統(tǒng)方法提取的原代干細(xì)胞5d后方可傳代。兩種方法提取的細(xì)胞1：2傳代后增殖速度及生物特性上無明顯差別，均為傳代后4～6h開始貼壁，經(jīng)過較短的潛伏期后開始增殖，約每3d傳一代。

2.5脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo) 對(duì)兩種方法提取的第二代脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，行油紅染色O染色后兩者均誘導(dǎo)成功，無明顯差別。

3　討論

在目前肝臟來源短缺的情況下，如何使受損肝臟再生從而恢復(fù)正常肝功能對(duì)晚期肝病患者十分重要。干細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)是首先需要解決的問題。2001年Zuk等［1］首次從脂肪組織中提取并培養(yǎng)出ADSCs后，眾多的研究發(fā)現(xiàn)ADSCs具有和MSCs相似的生物學(xué)特性，在相應(yīng)的誘導(dǎo)環(huán)境下可以向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及肝細(xì)胞分化［4～12］，表現(xiàn)出成體干細(xì)胞的橫向分化能力。此外，ADSCs還具有取材方便、分布廣泛等MSCs所不具有的優(yōu)點(diǎn)，因此ADSCs可以作為干細(xì)胞移植的首選種子細(xì)胞，有非常重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。

脂肪干細(xì)胞傳統(tǒng)提取方法步驟多，隨之帶來了提取時(shí)間長，容易污染，提取過程中細(xì)胞損失量多等諸多問題。在提取脂肪干細(xì)胞的過程中，膠原酶主要起到消化脂肪組織中的膠原組織，使細(xì)胞松散，便于干細(xì)胞脫落的作用。一定程度上提高膠原酶濃度，縮短消化時(shí)間，既可以顯著增加干細(xì)胞提取量，又可以減少操作時(shí)間，降低污染可能性，也不會(huì)出現(xiàn)干細(xì)胞生物學(xué)特性和分化能力的改變。此外，NH4Cl主要作用是裂解紅細(xì)胞，如果濃度或裂解時(shí)間控制不佳，會(huì)對(duì)干細(xì)胞造成損害，可能會(huì)影響干細(xì)胞提取的數(shù)量和干細(xì)胞的生物學(xué)特性及分化潛能；篩網(wǎng)濾過是物理性過程，主要目的是將細(xì)胞懸液中的一些比較大塊的組織碎片去除，過濾的過程必定伴隨著干細(xì)胞的損失和污染可能；脂肪干細(xì)胞提取過程中每增加一個(gè)步驟，就會(huì)增加一次細(xì)胞懸液離心過程，離心的過程也會(huì)造成細(xì)胞丟失和一定程度的損害。由此，將NH4Cl裂解紅細(xì)胞及篩網(wǎng)過濾懸液去除脂肪組織的步驟省去，這會(huì)造成視野不清晰，對(duì)干細(xì)胞的觀察不能達(dá)到十分理想的效果，但目前對(duì)原代脂肪干細(xì)胞生物學(xué)特性的了解已經(jīng)十分深入，因此原代干細(xì)胞視野欠清并不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)研究造成限制性影響。

本資料結(jié)果顯示，改良法提取脂肪干細(xì)胞能夠顯著的增加細(xì)胞提取數(shù)量，縮短提取時(shí)間，降低原代細(xì)胞污染率，且不會(huì)影響細(xì)胞生物學(xué)特性及分化能力，是一種簡單有效的脂肪干細(xì)胞提取方法。

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·診治分析·

Objective Explore a simple and efficient extraction method of adipose-derived stem cell. Methods A comparison was made between an improved method and the conventional method, the former increased concentration of collagenase and saved the steps of erythrocyte lysis and fi ltration by screen on the basis of traditional method. Adipose-derived stem cells were respectively isolated by traditional method and improved method. Extration time and the quatity， biological characteristics and differentiation potential of adipose-derived stem cells were compared. Results the time for improved method was 70 minutes. There was no contamination in the fi ve cell bottles containing a lot of impurity. The time needed to passage was 3 days and the cells passaged grew well and were induced to adipocyte successfully. While the time for traditional method was 128 minutes. There was contamination in one cells bottle out of three bottles containing a little of impurity. The time needed to passage was 5 days and the cells passaged grew well and were induced to adipocyte successfully. Conclusion The modifi ed method can signifi cantly increase the quality of the extracted cells，shorten the extracting time and decrease the contamination rate of primary cells， while it would not affect the cell biological characteristics and the differentiation potential. So the method was simple and effective.

Adipose-derived stem cells Improved Extract

313300 浙江省安吉縣人民醫(yī)院（胡金靈 邵世飚）310028 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（梁廷波）