李道群，彭杰，甸子芩,，王文廣，張阿梅，馮悅，牛華，代解杰*，夏雪山*

(1. 昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明 650500；2. 昆明理工大學附屬醫(yī)院(云南省第一人民醫(yī)院)，昆明 650032；3. 中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩標準化研究與疾病動物模型創(chuàng)建省創(chuàng)新團隊，昆明 650118)

研究報告

人輪狀病毒G1P[8]型感染樹鼩原代小腸上皮細胞模型的建立

李道群1，彭杰1，甸子芩1,2，王文廣3，張阿梅1，馮悅1，牛華2，代解杰3*，夏雪山1*

(1. 昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明 650500；2. 昆明理工大學附屬醫(yī)院(云南省第一人民醫(yī)院)，昆明 650032；3. 中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩標準化研究與疾病動物模型創(chuàng)建省創(chuàng)新團隊，昆明 650118)

目的 探究樹鼩原代小腸上皮細胞的增殖特性，建立人輪狀G1P[8]型病毒體外感染樹鼩原代小腸上皮的細胞模型。方法 采用膠原酶XI和中性蛋白酶I聯(lián)合消化法獲取樹鼩原代小腸上皮細胞，經(jīng)純化和鑒定，用人輪狀G1P[8]型病毒感染細胞，測定培養(yǎng)上清的病毒滴度和載量，并用Western blot和間接免疫熒光檢測法檢測人輪狀病毒G1P[8]型VP6蛋白的表達情況，評價人輪狀G1P[8]型病毒體外對樹鼩原代小腸上皮細胞的感染性。結果 分離的樹鼩原代小腸上皮細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得純度達90%樹鼩原代小腸上皮細胞。對樹鼩原代小腸上皮細胞、原代腎細胞、HCT116細胞和MA104細胞進行輪狀病毒易感性比較，確定樹鼩原代小腸上皮細胞可以被人輪狀病毒G1P[8]感染，培養(yǎng)72 h時病毒滴度可達到2.0×105TCID50/mL。經(jīng)Western blot和間接免疫熒光發(fā)現(xiàn)在人輪狀G1P[8]型病毒感染樹鼩原代小腸上皮細胞1～5 d均能檢測到人輪狀病毒VP6蛋白的表達和分布。結論 確立了樹鼩原代小腸上皮細胞的分離、純化與培養(yǎng)方法，并建立了人輪狀G1P[8]型病毒感染樹鼩原代小腸上皮細胞的體外模型。

樹鼩原代小腸上皮細胞；輪狀病毒；病毒增殖特性；VP6蛋白

輪狀病毒(rotavirus, RV)感染是導致全球范圍內五歲以下嬰幼兒急性腸胃炎脫水腹瀉的主要原因，每年會導致44萬嬰幼兒死亡，對全世界嬰幼兒的公共健康構成了嚴重威脅[1]。中國是RV感染的多發(fā)區(qū)和高發(fā)區(qū)，嬰幼兒感染率高達65%，以人輪狀G1P[8]型病毒株感染群體為主[2]。雖然對RV的研究已經(jīng)有幾十年的歷史，但是目前仍沒有治療RV的特效藥物和理想的疫苗[3]。RV感染的動物模型可分為感染模型與疾病模型，成年豬、猴、牛、羊和鼠等可被病毒感染，但不出現(xiàn)腹瀉等顯著臨床癥狀，成為感染模型；幼齡乳鼠和無菌豬可被病毒感染并出現(xiàn)腹瀉等典型疾病癥狀，稱為疾病模型。RV感染大型哺乳動物飼養(yǎng)成本高、技術操作難度較大，而小型動物繁殖能力強、易于操作和成本低等優(yōu)勢，使得RV感染小型哺乳動物越來越得到人們的重視。由于動物屬性、病毒與動物對應性等因素的影響，RV感染模型、尤其人源RV感染模型與疾病模型較難建立，導致RV感染與致病的機制研究受到較大限制[4-6]。

樹鼩(Tupaiabelangeri, tree shrew)是一種攀鼩目的小型哺乳類動物，易飼養(yǎng)、管理和經(jīng)濟低廉，進化程度較高，在新陳代謝和解剖學特性等方面與人接近，是一種在生物醫(yī)學研究中很有應用價值的新型實驗動物。已有研究證實，多數(shù)對多種人類病毒易感，包括人甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)等[7-10]。萬新邦等[11]用含有RV的嬰兒糞便懸液對樹鼩進行灌胃，首次證實樹鼩對人RV易感。龐其方[12]和朱婉萍等[13]分別用中草藥和牛乳鐵蛋白對感染人RV的樹鼩模型進行治療，樹鼩排毒滴度、腹瀉和死亡率均得到改善。RV對樹鼩感染及致病性的初步確認，對在細胞層次探究RV的感染與致病性提出新的要求。

本研究成功建立了一種樹鼩原代小腸上皮細胞的分離方法，并進行了純化和鑒定，初步建立了人RV G1P[8]型病毒體外感染樹鼩原代樹鼩小腸上皮細胞模型。人RV感染樹鼩動物小腸上皮細胞模型的建立，可以為RV感染樹鼩原代小腸上皮細胞致病性研究提供新的證據(jù)，并佐證樹鼩疾病動物模型建立的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、病毒株和細胞

選用清潔級的3～4月齡子一代雄性健康中緬樹鼩5只，體重130～145 g，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質資源中心【SCXK(滇)2013-0001】，飼養(yǎng)和實驗操作均在昆明理工大學實驗動物中心進行。

RV標準株(菌株編號：GDV085)，來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，以MA104細胞進行擴增培養(yǎng)，經(jīng)測定其滴度為2.0×106TCID50/mL。

1.2 樹鼩原代小腸上皮細胞的培養(yǎng)和鑒定

按體重比例對樹鼩腹腔注射苯巴比妥進行麻醉。解剖取出小腸，延縱軸切開，用鑷子剔除腸道內容物和腸膜粘液，用含雙倍青鏈霉素的D-Hanks’洗滌5遍，將其剪成1 mm3左右的肉糜狀物，然后轉移至100 U/mL膠原酶XI和0.04 mg/mL的中性蛋白酶I的混合消化酶液中，37℃水浴30 min，每隔10 min漩渦振蕩30 s。待30 min消化完全后取出500 r/min離心5 min，棄去上清酶液，加入完全培養(yǎng)基洗滌1遍，然后加入含有2%山梨醇的組織分散液，500 r/min離心3 min(該步驟重復5次)。收集上清液轉移至新的離心管中，500 r/min離心15 min，棄去上清液，重懸細胞，接入T-25培養(yǎng)瓶中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液，至傳代。

為了獲取較為純的樹鼩原代小腸上皮細胞，本實驗采用了相差消化法和相差貼壁法。經(jīng)2～3代次培養(yǎng)即可獲得較純的小腸上皮細胞。鑒定使用角蛋白18(CK18)抗體(購自Abcam，使用根據(jù)說明書)進行免疫熒光檢測上皮樣細胞的比例和純度。1.3 RV病毒感染樹鼩原代小腸上皮細胞和病毒增殖特性

按感染復數(shù)為0.1(MOI=0.1)的RV病毒感染MA104細胞，維持培養(yǎng)至72 h時收取培養(yǎng)上清，為用于感染樹鼩原代小腸上皮細胞的病毒液。以感染復數(shù)為3(MOI=3)的RV病毒接種原代樹鼩原代小腸上皮細胞，同時設MA104細胞作為陽性對照，在培養(yǎng)箱中孵育2 h后棄除上清，使用PBS洗5遍，以最后1次洗液作為0 d對照，加入含1μg/mL胰酶的無血清DMEM維持培養(yǎng)液，放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)每隔12 h后收集感染上清，然后提取上清中的核酸，一步法RT-PCR檢測病毒核酸，上游引物VP6-F：TGTATGTATGGATGAAATGGC，下游引物VP6-R：TAATGGAAGCTACCGTGAAA，擴增片段為893 bp；TaqMan探針法熒光定量PCR檢測上清中的病毒載量，定量上游引物：RV-F1(891-914 bp)-TTATTATTTCAGTTGATGCGTCCA，下游引物RV-R1(1034-1055 bp)-TGCTAACAGAGTTTCATTTGCG，探針序列為：Probe(947-972 bp)：TCCACAAGCACAACCTTTTCAGCACC，擴增片段為165 bp，具體操作步驟參閱[14]。

1.4 RV病毒滴度檢測

采用組織細胞培養(yǎng)半數(shù)感染劑量(50% tissue culture infective dose, TCID50)法測定，在96孔培養(yǎng)板中進行，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液將其按照1∶10稀釋成10-1～10-6等系列濃度，將培養(yǎng)成單層MA104細胞的96孔板用PBS洗滌2遍，再將不同稀釋度的病毒加入到96孔細胞培養(yǎng)板每孔100 μL，每個濃度重復6次。設置正常對照細胞，37℃孵育2 h后吸棄病毒液，加入無血清的細胞培養(yǎng)液200 μL/孔(含1 μL/mL胰酶)。37℃ 5%CO2培養(yǎng)，連續(xù)觀察。當能夠出現(xiàn)細胞病變CPE的最低稀釋度的病毒孔中，不再繼續(xù)出現(xiàn)CPE時，計數(shù)每個稀釋度出現(xiàn)CPE的細胞孔數(shù)，按照Reed-Muench方法計算病毒的TCID50。

1.5 RV VP6蛋白在樹鼩原代小腸上皮細胞中的表達

Western blot 檢測RV VP6蛋白表達。以感染復數(shù)為3(MOI=3)將RV接種到鋪有樹鼩原代小腸上皮細胞的6孔板中，分別收取1、3 d和5 d被感染細胞，提取總蛋白，蛋白定量后，上樣量均為20 μg，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后用一抗和二抗進行細胞中RV VP6蛋白檢測(anti-mouse VP6 一抗和HRP二抗均購自Abcam，具體使用根據(jù)說明書)。

間接免疫熒光法檢測RV VP6蛋白在樹鼩小腸上皮細胞中的表達分布情況。細胞感染48 h后甲醇固定，經(jīng)一抗和二抗標記，熒光顯微鏡下檢測被感染細胞中VP6蛋白的分布情況(anti-mouse VP6一抗和 goat anti-mouse FITC二抗均購自Abcam，具體使用參照說明書)。

2 結果

2.1 樹鼩原代小腸上皮細胞的分離及鑒定

細胞培養(yǎng)條件：DMEM(88%)+ FBS(10%)+青鏈霉素(1%)+EGF(10 ng/mL)+DMSO(1%)+肝素鈉(100 μg/mL)+胰島素(2.5 μg/mL)，將樹鼩的原代小腸上皮細胞分離后進行培養(yǎng)至第5天，可見細胞形態(tài)呈現(xiàn)出不規(guī)則多邊形的上皮樣，細胞之間輪廓清晰(圖1a)，生長旺盛。經(jīng)過2代次純化，紅圈部分中的成纖維細胞逐漸減少(圖1b、c)，通過角蛋白CK18抗體進行免疫熒光鑒定，可見幾乎所有的細胞都呈現(xiàn)出綠色熒光，樹鼩原代小腸上皮細胞的純度達90%(圖1d)。

注：a：樹鼩原代小腸上皮細胞(100×)；b：經(jīng)過第1代純化的原代小腸上皮細胞形態(tài)(100×)；c：經(jīng)過第2代純化的原代小腸上皮細胞形態(tài)(100×)；d：原代小腸上皮細胞免疫組化染色(100×)。紅圈部分為夾雜著成纖維細胞的樹鼩原代小腸上皮細胞。圖1 樹鼩原代小腸上皮細胞的培養(yǎng)、純化和鑒定Note. a: Primary small intestinal epithelial cells from tree shrew (100×); b: Morphology of the first generation primary intestinal epithelial cells after of purification (100×); c: Morphology of the second generation primary intestinal epithelial cells after purification (100×); d: Immunohistochemical staining of primary small intestinal epithelial cells (100×).Fig.1 Culture, purification and identification of the primary small intestinal epithelial cells from tree shrew

2.2 樹鼩原代小腸上皮細胞的培養(yǎng)和增殖

通過MTT法測定樹鼩原代小腸上皮細胞細胞活力(維持培養(yǎng)至16 d)，并繪制細胞生長增殖曲線(圖2)。結果表明樹鼩原代小腸上皮細胞在培養(yǎng)至10 d時，細胞的增殖一直呈現(xiàn)上升趨勢比MA104達到增殖平臺期慢些(10 d左右達到增殖平臺期)。而10～12 d的平臺期中，樹鼩的原代小腸上皮細胞增殖能力較MA104細胞呈下降趨勢，同時12 d以后細胞增殖均開始下降，表明原代小腸上皮細胞和MA104細胞開始發(fā)生凋亡。

圖2 樹鼩小腸上皮細胞增殖曲線Fig.2 Growth curves of the tree shrew small intestinal epithelial cells

2.3 RV感染樹鼩原代小腸上皮細胞與病毒的增殖

將RV病毒接種至單層MA104細胞中，添加1 μg/mL胰酶的無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后收取上清。經(jīng)測定病毒的滴度為2.0×106TCID50/mL。

收集RV感染樹鼩原代小腸上皮細胞的0 d洗滌液和未感染及感染5 d后的培養(yǎng)上清，提取病毒核酸進行RT-PCR檢測，結果如圖3a所示，樹鼩原代小腸上皮細胞、樹鼩原代腎細胞、HCT116和MA104細胞的培養(yǎng)上清中均擴增檢測到核酸片段，大小為165 bp，而未感染陰性對照組未擴增出目的條帶。

用實驗室建立的Taqman探針法檢測感染前后上清的病毒載量，發(fā)現(xiàn)感染樹鼩原代小腸上皮細胞培養(yǎng)上清的病毒載量為5.32×104copies/μL，明顯高于其0 d洗液(1.6×102copies/μL)；對照組MA104細胞感染后的培養(yǎng)上清病毒載量(7.75×106copies/μL)和樹鼩原代小腸細胞感染后差異顯著，相對0 d洗液均增殖，與樹鼩原代腎原代(1.7×104copies/μL)和HCT116(7.52×104copies/μL)差異無顯著性，如圖3-(b)所示。

注：(a)M. DL2000 marker；1. RV感染樹鼩原代小腸上皮細胞0 d洗液； 2. RV感染樹鼩原代腎細胞培養(yǎng)5 d上清； 3. RV感染樹鼩原代小腸上皮細胞培養(yǎng)5 d上清； 4. RV感染HCT116培養(yǎng)5 d上清； 5. RV感染MA104培養(yǎng)5 d上清； 6. 未感染樹鼩小腸上皮細胞培養(yǎng)5 d上清。(b)ns為差異無顯著性；*表示P<0.05差異有顯著性。圖3 RV感染樹鼩原代小腸上皮細胞的檢測Note. a: M, DL2000 marker. 1. Wash solution of the small intestinal epithelial cells after RV infection; 2. The culture supernatant of primary renal cells of tree shrew at 5 days after RV infection. 3. The culture supernatant of primary small intestinal epithelial cells of tree shrew at 5 days after infection. 4. The culture supernatant of HCT116 cells at 5 days after infection. 5. The culture supernatant of MA104 cells at 5 days after infection. b: ns represents non-significant differences; *P<0.05, significant differences.WS:wash solution;PRC:primary renal cells;IEC:Intestinal epithelial cells.Fig.3 Detection of RV-infected primary small intestinal epithelial cells of the tree shrew

將RV按最適感染復數(shù)(MOI=3)接種至單層樹鼩原代小腸上皮細胞中，然后每隔12 h收取培養(yǎng)上清，連續(xù)收取5 d，測定其載量和滴度，繪制RV感染樹鼩原代小腸上皮細胞的增殖曲線(圖4)。病毒感染樹鼩原代小腸上皮細胞后，滴度和載量呈現(xiàn)逐漸遞增，兩者變化基本一致，在輪狀病毒感染72 h后，病毒滴度和載量均出現(xiàn)最大值2.0×105TCID50/mL和約為1×106copies/mL，之后出現(xiàn)了上下波動的狀況，通過0～120 h的RV感染滴度和載量變化趨勢，說明RV病毒能夠在樹鼩原代小腸上皮細胞上復制和增殖。

圖4 RV在樹鼩原代小腸上皮細胞中的增殖曲線Fig.4 Proliferation curves of RV in the primary small intestinal epithelial cells of tree shrew

2.4 Western blot 檢測RV VP6蛋白在樹鼩原代小腸上皮細胞中的表達

原代小腸上皮細胞感染后的第1天就可以檢測到RV VP6蛋白的表達，同時在5 d內均能夠檢測到RV VP6蛋白表達。其中第1天表達量低，第5天表達較高(見圖5)。未感染RV病毒5 d原代小腸上皮細胞(陰性對照)未檢測到VP6蛋白的表達，陽性對照RV感染MA104細胞5 d可檢到VP6蛋白表達。

圖5 Western blot檢測RV VP6蛋白在樹鼩原代小腸上皮細胞中的表達Fig.5 Western blot results of the expression of RV VP6 protein in the primary small intestinal epithelial cells of tree shrew

免疫熒光檢測RV感染48 h的樹鼩原代小腸上皮細胞，結果表明：RV VP6蛋白表達情況相對于陰性未感染輪狀病毒的樹鼩原代小腸上皮細胞來說，只能見到DAPI復染的細胞核(見圖6)。而RV感染樹鼩原代小腸上皮細胞可以觀察到VP6蛋白分布于細胞核的邊緣，主要圍繞在細胞的胞質中，表明RVVP6蛋白主要在被感染細胞的細胞質中表達，并且在細胞內進行RV復制活動。這一現(xiàn)象和同一時間段RV感染宿主MA104細胞后的現(xiàn)象相一致。

圖6 免疫熒光檢測RV VP6在樹鼩原代小腸上皮細胞中的表達Fig.6 Expression of RV VP6 protein in the primary small intestinal epithelial cells of tree shrew detected by immunofluorescence

3 討論

RV感染動物模型主要是以幼齡小鼠、乳鼠、無菌豬、兔以及猴作為研究對象，但是小鼠在遺傳和親緣關系上與人較遠，而非人靈長類的猴等大型哺乳類動物的成本較高。樹鼩作為一種新的低等靈長類動物，因其與人類的親緣關系較近、成本低、繁育周期短等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛應用于人類相關重大疾病的研究[7]。最近，龐其方[12]和朱婉萍等[13]在與人發(fā)病機理相似的樹鼩感染輪狀病毒模型基礎上，采用藥物治療人RV感染進行了評價，但均未對人RV感染樹鼩病毒亞型、樹鼩胃腸道細胞易感性、感染特性和細胞病變等方面進行更為詳細的研究，限制了其進一步的應用價值。本研究通過建立原代樹鼩小腸上皮細胞體外感染模型，從原代小腸上皮細胞增殖、病毒感染原代細胞特征等研究，為RV在樹鼩原代小腸上皮細胞內的復制特性和樹鼩體內模型的優(yōu)化提供了依據(jù)。采用混合酶液消化法獲取樹鼩原代小腸上皮細胞，對培養(yǎng)條件優(yōu)化和細胞鑒定[15,16]。本文對樹鼩原代小腸上皮細胞生長增殖特性研究發(fā)現(xiàn)：樹鼩原代小腸上皮細胞在12 d以內完成對數(shù)生長期至平臺期，并能在對數(shù)期維持生長活力，說明樹鼩原代小腸上皮細胞能夠滿足體外人RV感染實驗的條件。

其次，對RV感染樹鼩原代小腸上皮細胞5 d內的蛋白和病毒載量的測定，表明RV感染樹鼩原代小腸上皮細胞后，確實存在RV RNA的復制和蛋白表達量的增長。同時對RV感染不同宿主細胞(MA104)的研究，病毒表達水平由高到低依次為MA104 > HCT116 >樹鼩原代小腸上皮細胞>樹鼩原代腎細胞。可能是對非宿主細胞的選擇性適應能力不同所造成感染效率存在差異所致。間接免疫熒光結果表明，陰性對照未檢測到病毒VP6蛋白表達，僅可見細胞核存在，而陽性MA104細胞可見明顯細胞核和病毒蛋白VP6的表達，樹鼩原代小腸上皮細胞，同樣存在明顯的病毒蛋白VP6的表達，證明了輪狀病毒對樹鼩原代小腸上皮細胞的易感性。

本研究成功分離并優(yōu)化了樹鼩原代小腸上皮細胞的培養(yǎng)條件，得到較純且生長狀態(tài)良好的原代小腸上皮細胞，成功建立了人RV G1P[8]型病毒體外感染樹鼩小腸上皮細胞模型。通過被感染小腸上皮細胞內外病毒的核酸和蛋白水平的表達檢測，均能夠證明人RV可以感染體外樹鼩原代小腸上皮細胞。這些研究結果為進一步深入研究人RV的體外感染機制奠定了基礎，也為人RV樹鼩活體感染模型與疾病模型的建立提供佐證。

[1] Shao L, Fischer D D, Kandasamy S,et al. Comparative in vitro and in vivo studies of porcine rotavirus G9P [13] and human rotavirus Wa G1P [8][J]. J Virol, 2016, 90(1): 142-151.

[2] Dian Z, Fan M, Wang B, et al. The prevalence and genotype distribution of rotavirus A infection among children with acute gastroenteritis in Kunming, China[J]. Arch Virol, 2017，162(1): 281-285.

[3] 黃敏, 黃英. 輪狀病毒腹瀉研究進展[J]. 華西醫(yī)學, 2014, 29(4): 780-782.

[4] 宋麗軍, 趙文昌, 譚曉梅, 等. Wa 株輪狀病毒感染昆明小鼠乳鼠腹瀉模型的建立及影響因素考察[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2013, 15(4): 11-14.

[5] 陳渙. 中藥止瀉液對鼠輪狀病毒腸炎腸道水通道蛋白影響的研究[D]. 廣州醫(yī)學院, 2009.

[6] 羅軍, 孫曉梅, 宋志忠, 等. 輪狀病毒感染實驗動物模型的研究進展[J]. 實驗動物科學 ISTIC, 2015, 32(1): 48-50, 54.

[7] 鄭永唐, 姚永剛, 徐林. 樹鼩基礎生物學與疾病模型[M]. 云南科技出版社，2014.

[8] 陳瑾, 代解杰, 孫曉梅. 樹鼩肝炎動物模型的研究進展[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2008, 18(2): 59-62.

[9] 崔照瓊, 楊衛(wèi), 李艷瓊, 等. 樹鼩 HSV-1 感染模型的建立[J].中國病原生物學雜志, 2016，11(4):325-328.

[10] 戴長柏. 人單純皰疹病毒Ⅱ型 (HSV-II) 實驗感染樹鼩的研究[J]. 動物學研究, 1985, 6(3): 53, 71

[11] 萬新邦, 龐其方, 丘福禧, 等. 成年的中國云南樹鼩對人輪狀病毒易感性的實驗研究[J]. 中華微生物學和免疫學雜志, 1985, 5(4): 304-306.

[12] 龐其方, 萬新邦, 丘福喜. 中草藥 “秋瀉靈”實驗治療樹鼩人工感染輪狀病毒腸炎的研究[J]. 昆明醫(yī)學院學報, 1983, 4(3): 7.

[13] 朱婉萍, 孔繁智. 牛乳鐵蛋白對感染輪狀病毒樹鼩的治療試驗[J]. 中國現(xiàn)代應用藥學, 2012, 29(5): 397-400.

[14] 彭杰, 胡曉星, 馮悅, 等. 人 G1 型輪狀病毒 TaqMan 熒光定量檢測方法的建立與應用[J]. 中國人獸共患病學報, 2016, 32(6): 512-517.

[15] Macartney KK, Baumgart DC, Carding SR, et al. Primary murine small intestinal epithelial cells, maintained in long-term culture, are susceptible to rotavirus infection[J]. JVirol, 2000, 74(12): 5597-5603.

[16] 王靜, 張彥明, 仝鋼, 等. 新生仔豬小腸上皮細胞的分離培養(yǎng)和鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2010, 41(1): 92-98.

Establishment of a model of tree shrew primary small intestinal epithelial cells infected with human rotavirus G1P[8]

LI Dao-qun1，PENG Jie1，DIAN Zi-qin1,2，WANG Wen-guang3，ZHANGA A-mei1，F(xiàn)ENG Yue1，NIU Hua2，DAI Jie-jie3*，XIA Xue-shan1*

(1. Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China; 2. The Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology, Kunming 650034; 3. Yunnan Provincial Innovation Group of Tree Shrew Standard Culture and Animal Model, Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Kunming 650118)

Objective To explore the proliferation characteristics of primary small intestinal epithelial cells of tree shrews and the characteristics of human rotavirus (RV) G1P[8] infection to these cells, and establish a model of tree shrew primary small intestinal epithelial cells infected with human rotavirus G1P[8]. Methods The primary small intestinal epithelial cells were obtained by collagenase XI and dispase I digestion from tree shrew. After purification and identification, the obtained primary small intestinal epithelial cells were infected with RV. Then, culture supernatants of infected cells were collected every 12 hours after infection. Viral titer and viral load were subsequently determined. Western blot and indirect immunofluorescence observation were used to detect the expression of RV protein VP6 in the primary cells. The infectivity of RV to the tree shrew primary cells was finally evaluated.Results After purification and identification of primary epithelial cells from the tree shrew, high purity above 90% primary tree shrew small intestinal epithelial cells was obtained. These primary small intestinal epithelial cells could be infected with RV virus by comparing the virus infectivity to primary renal cells, HCT116 cells and MA104 cells. The virus titer reached to 2.0×105TCID50/mL at 72 h after infection. Using Western blot and indirect immunofluorescence observation, the specific viral protein of VP6 was determined to be expressed in the tree shrew primary small intestinal epithelial cells, and were located in the cytoplasm from days 1 to 5. Conclusions The separation, purification and cultivation methods of tree shrew primary small intestinal epithelial cells are successful, and the tree shrew model of RV-infected the tree shrew primary small intestinal epithelial cells is successfully established.

Primary intestinal epithelial cells, Tree shrews；Rotavirus；Virus proliferation；Protein VP6

XIA Xue-shan, E-mail: oliverxia2000@aliyun.com；DAI Jie-jie, E-mail: djj@imbcams.com.cn

國家科技支撐計劃項目(編號：2014BAI01B01)。

李道群(1988-)，男，博士研究生，研究方向：病毒樹鼩模型。E-mail： lidaoqunyq@163.com

夏雪山，教授，研究方向：分子病毒學，E-mail： oliverxia2000@aliyun.com； 代解杰，研究員，主要研究方向：疾病動物模型，E-mail： djj@imbcams.com.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0111-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.001

2016-12-06