賀海斌 劉青光 楊威

熱休克蛋白70反義寡核苷酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

賀海斌 劉青光 楊威

目的 探討熱休克蛋白70反義寡核苷酸(HSP70 ASODN)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其可能機(jī)制。方法 合成特異性靶向HSP70 ASODN，并將其轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞；四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)HSP70 ASODN對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率；熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)；免疫細(xì)胞化學(xué)觀察細(xì)胞內(nèi)HSP70、Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果 ASODN組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯高于正義寡核苷酸（NSODN）組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組及空白對(duì)照組（P＜0.05）；形態(tài)學(xué)觀察到典型瘤細(xì)胞凋亡特征；流式細(xì)胞儀分析證實(shí)HSP70 ASODN主要阻止瘤細(xì)胞進(jìn)入S期，細(xì)胞增殖指數(shù)下降，出現(xiàn)明顯的凋亡峰；免疫細(xì)胞化學(xué)顯示可降低細(xì)胞內(nèi)HSP70、Bcl-2水平（P＜0.05），提升Bax水平（P＜0.05）。結(jié)論 HSP70 ASODN可抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，可能機(jī)制為中和了HSP70和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白間的相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，打破了腫瘤細(xì)胞逃逸凋亡平衡，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌 熱休克蛋白70 反義寡核苷酸 凋亡

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of heat shock protein 70 antisense oligonucleotide on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721. Methods Human HCC cell line SMMC-7721 was transfected in vitro with heat shock protein antisense oligonucleotide mediated by SofastTM.Cell growth inhibition was determined as percentage by the colorimetric MTT cell viability/proliferation assay.Cell morphological change of apoptosis was observed with fluorescence microscope.Distribution of cell cycle was analyzed by flow cytometry.Immunocytochemistry staining was used to observe the intra-cellular expression of HSP70、Bcl-2、Bax. Results The inhibiting proliferation rate of SMMC-7721 cells increased with the treatment dose and incubation time of HSP70 ASODN.These effects were not observed in the cells treated with normal sense oligonucleotide or SofastTM Transfection Reagent.Apoptotic bodies were observed in SMMC-7721 cells treated with HSP70 ASODN at a concentration of 400nmol/L for 48h.Cytometric analysis showed a significant decrease in the percentage of G2/M and S-phases while a significant increase in the percentage of G0/G1 among the total cells treated with HSP70 ASODN. The results showed that treatment of SMMC-7721 cells with HSP70 ASODN for 48h resulted in a inhibition of HSP70 and Bcl-2 expression,and an increased expression of Bax.While treatment with HSP70 normal sense oligonucleotide for 48h had no effect on expression of these proteins. Conclusion The abrogation of HSP70 by HSP70 ASODN exclusively can inhibit cell growth and induce cell apoptosis.

目前，原發(fā)性肝細(xì)胞癌的臨床治療效果仍不能令人滿(mǎn)意；基因治療是通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞的分子基礎(chǔ)從而根本上抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，且對(duì)正常細(xì)胞的影響較小。筆者通過(guò)設(shè)計(jì)合成熱休克蛋白70反義寡核苷酸 （heat shock protein 70 antisense oligonucleotide， HSP70 ASODN）片段，體外轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞，觀察和分析其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討HSP70 ASODN治療原發(fā)性肝細(xì)胞癌的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 FCS（杭州四季青公司）；Tris堿（美國(guó)Promega公司）；鼠抗人HSP70抗體（工作液）、鼠抗人Bcl-2抗體（工作液）、鼠抗人Bax抗體（工作液）、SP-9002試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；二甲亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、碘化丙啶（美國(guó)Sigma公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液（美國(guó)GIBCO公司）；細(xì)胞凋亡-Hoechst 33258染色試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；梭華-SofastTM（廈門(mén)太陽(yáng)馬生物工程有限公司）；HSP70 ASODN、正義寡核苷酸（NSODN）（上海生工生物工程有限公司）。超凈臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；CO2孵育箱、低溫離心機(jī)、全自動(dòng)純水裝置、酶標(biāo)儀（德國(guó)Heraeus公司）；倒置顯微鏡、數(shù)碼相機(jī)（日本Olympus公司）；恒溫水浴箱、高壓鍋、液氮罐（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）；78-1磁力加溫?cái)嚢杵鳎ê贾輧x表電機(jī)廠）；電子天平（德國(guó)Bosch公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；微量移液器、高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；恒溫鼓風(fēng)干燥爐（寧波自動(dòng)化儀表廠）；熒光照相顯微鏡（LEICA DM LB2，德國(guó)Leica公司）；精密電子天平（瑞士Mettler公司）；濾膜（天津東康公司）；過(guò)濾器（德國(guó)Sartorius公司）；高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭公司）；水平搖床（北京六一公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板（青島博維生物科技公司）。

1.2 HSP70 ASODN的設(shè)計(jì)與合成 針對(duì)HSP70 mRNA翻譯起始密碼子及下游5個(gè)密碼子設(shè)計(jì)HSP70 ASODN，HSP70 ASODN 5′-CGCCGCGGCTTTGGCCAT-3′、HSP70 NSODN 5′-ATGGCCAAAGCCGCGGCG-3′，均經(jīng)全程硫代修飾，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株（SMMC-7721）由第二軍醫(yī)大學(xué)病理解剖學(xué)教研室建株，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心惠贈(zèng)，為高轉(zhuǎn)移高侵襲細(xì)胞。采用含10%滅活小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA（北京中杉生物技術(shù)有限公司）消化傳代。

1.4 四甲基噻唑藍(lán)（MTT）法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液配成5×104個(gè)/ ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔175μl，加入藥物后終體積為200μl。隨機(jī)分成4組，每組復(fù)設(shè)6孔。量效實(shí)驗(yàn)：（1）ASODN組：分別以100、200、400、600nmol/L A SODN轉(zhuǎn)染 SMMC-7721細(xì)胞；（2）NSODN組：以400nmol/L NSODN轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞；（3）轉(zhuǎn)染試劑組：加入等量梭華-SofastTM；（4）空白對(duì)照組：加等量RPMI-1640培養(yǎng)液。按梭華-SofastTM轉(zhuǎn)染試劑盒（廈門(mén)太陽(yáng)馬生物工程有限公司）說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在上述條件下繼續(xù)48h終止培養(yǎng)。時(shí)效實(shí)驗(yàn)：選擇量效實(shí)驗(yàn)最佳濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72h終止培養(yǎng)。每孔加入0.5%MTT液20μl，繼續(xù)孵育4h，傾盡上清液，每孔加入DMSO150μl，搖床上搖動(dòng)10min充分溶解甲瓚，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各孔光濃度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD）/對(duì)照組OD×100%。

1.5 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡 2×105個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，接種在放置有預(yù)先處理過(guò)的蓋玻片的24孔板內(nèi)，每孔438μl，培養(yǎng)24h后換液。隨機(jī)分為3組：400nmol/LHSP70 NSODN作用組、400nmol/LHSP70 ASODN作用組、正常對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔，加入RPMI-1640培養(yǎng)液，終體積均為500μl，繼續(xù)培養(yǎng)48h后終止。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色封片。置熒光顯微鏡下觀察并攝影，激發(fā)波長(zhǎng)350nm，發(fā)射波長(zhǎng)460nm。

1.6 流式細(xì)胞儀分析腫瘤細(xì)胞增殖周期分布 2×105個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，接種50ml培養(yǎng)瓶，每瓶4ml，培養(yǎng)24h后換液。隨機(jī)分為3組：400nmol/LHSP70 NSODN作用組、400nmol/L HSP70 ASODN作用組、正常對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48h后終止。消化吹打成細(xì)胞懸液，離心1 500r/min×5min；細(xì)胞被重新懸浮于1ml冷鹽水中，慢慢加入-20℃95%的乙醇3ml，其最終濃度為70%，并輕輕吹打，冰浴30min，4℃固定，過(guò)夜；再離心，1 500r/ min×5min，PBS液洗2遍；細(xì)胞沉淀中加入0.1%RNA酶溶液150μl，重懸細(xì)胞，4℃30min；再加入0.1%碘化丙啶染色液120μl混勻，4℃避光孵育15min。進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。采用ModFit軟件分析，統(tǒng)計(jì)各時(shí)相細(xì)胞的百分比，記錄分布圖，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）：PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。

1.7 免疫細(xì)胞化學(xué) 2×105個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，接種在放置有預(yù)先處理過(guò)的蓋玻片的24孔板內(nèi)，每孔438μl，培養(yǎng)24h后換液。隨機(jī)分為3組：400nmol/ LHSP70 NSODN作用組、400nmol/LHSP70 ASODN作用組、對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔，加入RPMI-1640培養(yǎng)液，終體積均為500μl，繼續(xù)培養(yǎng)48h后終止。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色封片。用10%多聚甲醛室溫固定爬片細(xì)胞30min；吸出固定液，用PBS液手動(dòng)輕輕晃動(dòng)洗3遍；在爬片上滴加3%H2O2去離子水，室溫孵育5～10min；滴加正常山羊血清工作液，室溫孵育10～15min后，棄去血清；滴加一抗（HSP70、Bcl-2、Bax均為工作液），置4℃冰箱過(guò)夜；用PBS液手動(dòng)輕輕晃動(dòng)洗3遍；滴加生物素化羊抗小鼠IgG，-37℃孵育10～15min；用PBS液手動(dòng)輕輕晃動(dòng)洗3遍；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），室溫孵育10～15min；用PBS液手動(dòng)輕輕晃動(dòng)洗3遍；滴加二胺基聯(lián)苯胺（DAB液）顯色1～ 30min，肉眼和鏡下觀察顯色效果；自來(lái)水充分沖洗，終止顯色，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。Nikeo光學(xué)顯微鏡觀察，Galaxy S攝像顯微鏡聯(lián)合Motic Images Advanced軟件采集圖像，并進(jìn)行灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HSP70 ASODN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 MTT法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率發(fā)現(xiàn)，HSP70 ASODN轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞后各時(shí)間段，細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到顯著抑制，且這種作用呈劑量依賴(lài)性，即隨著ASODN劑量的增加，細(xì)胞的生長(zhǎng)率隨之下降，詳見(jiàn)表1；在同一濃度400nmol/L下，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率升高，詳見(jiàn)表2；而NSODN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用不明顯，單純的轉(zhuǎn)染試劑梭華-SofastTM對(duì)細(xì)胞的毒性很小。

表1 各濃度NSODN、ASODN作用48h對(duì)細(xì)胞增殖的影響

表2 400nmol/L ASODN作用24、48、72h對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.2 HSP70 ASODN對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 DNA熒光染料Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)，HSP70 ASODN作用SMMC-7721細(xì)胞48h后，細(xì)胞發(fā)生凋亡。經(jīng)DNA熒光染料Hoechst33258染色后，空白對(duì)照組的細(xì)胞膜完整，細(xì)胞質(zhì)豐富而飽滿(mǎn)，呈現(xiàn)亮度、大小均勻一致的圓形或類(lèi)圓形細(xì)胞核淺藍(lán)色熒光，而經(jīng)過(guò)400nmol/L HSP70 ASODN處理48h后，可見(jiàn)核染色質(zhì)凝集及邊緣化的細(xì)胞，部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)凋亡小體，核膜消失或突起呈小泡樣，核質(zhì)濃縮、碎裂。凋亡小體表現(xiàn)為邊緣模糊、皺縮、明顯較周?chē)＜?xì)胞核小、高亮藍(lán)色的熒光團(tuán)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 Hoechst33258染色細(xì)胞凋亡圖（A：空白對(duì)照組；B：正義寡核苷酸組；C：反義寡核苷酸組；箭頭示凋亡小體；×400）

2.3 HSP70 ASODN對(duì)細(xì)胞周期分布的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HSP70 ASODN處理后，G2/M期細(xì)胞比例顯著降低，S期細(xì)胞比例下降，G0/G1期細(xì)胞比例顯著上升，G0/G1期細(xì)胞PI由空白對(duì)照組的36.69%升至53.55%，S期細(xì)胞則由59.21%降至46.45%，G2/M期細(xì)胞幾近消失，說(shuō)明細(xì)胞主要被阻斷在G0/G1期，細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯下降；NSODN組細(xì)胞各期分布自然，PI維持在64.06%，詳見(jiàn)表3。

表3 3組各細(xì)胞周期PI的比較（%）

2.4 HSP70 ASODN對(duì)細(xì)胞內(nèi)HSP70、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 免疫細(xì)胞化學(xué)顯示人肝癌SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)HSP70有較高表達(dá)，主要在細(xì)胞質(zhì)；Bcl-2呈現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)棕褐色著色，核膜上星點(diǎn)狀輕微著色；Bax微弱表達(dá)，主要在細(xì)胞質(zhì)。圖像灰度值分析顯示，經(jīng)HSP70 ASODN處理48h后，圖像灰度值逐漸升高，與空白對(duì)照組及NSODN組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)HSP70顯著下降（P＜0.01）；Bcl-2在處理后表達(dá)顯著下降（P＜0.01）；Bax在處理后表達(dá)有顯著升高（P＜0.01）。NSODN組各檢測(cè)蛋白圖像的灰度值與空白對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，詳見(jiàn)表4。

表4 HSP70、Bcl-2、Bax的免疫細(xì)胞化學(xué)圖像分析灰度值表

3 討論

熱休克蛋白屬于分子伴侶超家族成員，是細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的生物化學(xué)調(diào)節(jié)劑[1-2]。在腫瘤細(xì)胞中，多種熱休克蛋白高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、抗凋亡、免疫逃逸、惡性行為及不良預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。近年來(lái)的研究表明，HSP70在肝細(xì)胞肝癌中高表達(dá)，是鑒別早期肝細(xì)胞肝癌與肝臟癌前病變、非腫瘤性肝病的良好生物學(xué)標(biāo)志之一，細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生的HSP70有強(qiáng)大的抗凋亡作用，能夠保護(hù)、挽救細(xì)胞，防止細(xì)胞通過(guò)凋亡途徑死亡[5-7]?？沟蛲鲎饔迷谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥方面起重要作用，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和增強(qiáng)化療藥物的敏感性成為近年來(lái)腫瘤治療的重要策略。

本研究采用HSP70 ASODN阻斷人肝癌癌細(xì)胞SMMC-7721內(nèi)HSP70的表達(dá)，以了解HSP70對(duì)人肝癌癌細(xì)胞的增殖和存活的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSP70 ASODN不僅使SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制并且誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，并且呈時(shí)間劑量依賴(lài)性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G2/M期細(xì)胞比例顯著降低，S期細(xì)胞比例下降，G0/G1期細(xì)胞比例顯著上升，有亞二倍體峰出現(xiàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示細(xì)胞內(nèi)HSP70、Bcl-2水平顯著降低，Bax水平提升，而B(niǎo)cl-2、Bax分別是Bcl-2家族中兩個(gè)重要的抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白，其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡活動(dòng)中可能與HSP70有關(guān)[8-10]。由此推測(cè)，HSP70 ASODN抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制為中和了HSP70和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白間的相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，打破了腫瘤細(xì)胞逃逸凋亡平衡，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。

本研究結(jié)果表明，HSP70對(duì)腫瘤的增殖和存活起著重要作用，通過(guò)反義寡核苷酸技術(shù)單獨(dú)地抑制肝癌細(xì)胞中HSP70的表達(dá)即可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡顯著增加，細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制。為今后HSP70 ASODN應(yīng)用于肝癌的治療提供了新的理論依據(jù)，有望進(jìn)一步提高肝癌的臨床治療效果。

[1] Daugaard M,Rohde M,Jaattela M.The heat shock protein 70 family:highly homologous proteins with overlapping and distinct functions[J].FEBS Lett,2007,581(19):3702-3710.

[2] 裘天侖,金國(guó)良,王曉明,等.熱休克蛋白70在人挫傷腦組織中的表達(dá)及其意義[J].浙江醫(yī)學(xué),2007,29(3):219-221.

[3] Ciocca D R,Calderwood S K.Heat shock proteins in cancer: diagnostic,prognostic,predictive,and treatment implications [J].Cell Stress Chaperones,2005,10(2):86-103.

[4] Aurelie de Thonel,Valerie Mezger,Carmen Garrido.Implication of Heat Shock Factors in Tumorigenesis:Therapeutical Potential[J].Cancers,2011,3:1158-1181.

[5] Lee H W,Lee E H,Kim S H,et al.Heat shock protein 70 (HSP70)expression is associated with poor prognosis in intestinal type gastric cancer[J].Virchows Arch,2013,463(4): 489-495.

[6] Lim S O,Park S G,Yoo J H,et al.Expression of heat shock proteins (HSP27,HSP60,HSP70,HSP90,GRP78,GRP94)in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinomas and dysplastic nodules[J].World J Gastroenterol,2005,11(14):2072-2079.

[7] Wang X P,Wang Q X,Li H Y,et al.Heat shock protein 70 chaperoned alpha-fetoprotein in human hepatocellular carcinoma cellline BEL-7402[J].World J Gastroenterol,2005,11(35): 5561-5564.

[8] Kim J A,Kim Y,Kwon B M,et al.The natural compound cantharidin induces cancer cell death through inhibition of heat shock protein 70 (HSP70)and Bcl-2-associated athanogene domain 3 (BAG3)expression by blocking heat shock factor 1 (HSF1)binding to promoters[J].J Biol Chem,2013,288(40): 28713-28726.

[9] MacKenzie T N,Mujumdar N,Banerjee S,et al.Triptolide induces the expression of miR-142-3p:a negative regulator of heat shock protein 70 and pancreatic cancer cell proliferation [J].Mol Cancer Ther.2013,12(7):1266-1275.

[10] Yiu C C,Chanplakorn N,Chan M S,et al.Down-regulation of heat-shock protein 70 (HSP-70)correlated with responsiveness to neoadjuvant aromatase inhibitor therapy in breast cancer patients[J].Anticancer Res,2010,30(9):3465-3472.

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

《浙江醫(yī)學(xué)》對(duì)醫(yī)學(xué)論文中有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物描述的要求

在醫(yī)學(xué)論文的描述中，凡涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物者，在描述中應(yīng)符合以下要求：（1）品種、品系描述清楚，（2）強(qiáng)調(diào)來(lái)源，（3）遺傳背景，（4）微生物學(xué)質(zhì)量，（5）明確等級(jí)，（6）明確飼養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)環(huán)境，（7）明確性別，（8）有無(wú)質(zhì)量合格證，（9）有對(duì)飼養(yǎng)的描述（如飼料型、營(yíng)養(yǎng)水平、照明方式、溫度、溫度要求），（10）所有動(dòng)物數(shù)量準(zhǔn)確，（11）詳細(xì)描述動(dòng)物的健康狀況，（12）對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的處理方式有單獨(dú)清楚的交代，（13）全部有對(duì)照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

Effect of heat shock protein 70 antisense oligonucleotide on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell

HE Haibin,LIU Qingguang,YANG Wei.
Department of General Surgery,Ningbo Medical Treatment center Lihuili Hospital,Ningbo 315040,China

Primary hepatocellular cancer Heat shock protein 70 Antisense oligonucleotide Apoptosis

2014-07-21）

315040 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院普通外科（賀海斌）；西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科（劉青光、楊威）

劉青光，E-mail:liuqingguang@vip.sina.com.