王震 李凱強(qiáng) 陳秉宇 郝珂 何徐軍 牟曉洲 陶厚權(quán) 應(yīng)優(yōu)敏 張威

●論 著

烏骨藤粗提物對大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的體外實驗研究

王震 李凱強(qiáng) 陳秉宇 郝珂 何徐軍 牟曉洲 陶厚權(quán) 應(yīng)優(yōu)敏 張威

目的 觀察烏骨藤粗提取物（MTE）不同組分對大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況的影響，探討其作用機(jī)制。方法 采用新型四氮唑鹽法（MTS）檢測MTE的Fr1、Fr2、Fr3組分對C6細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測Fr2對C6細(xì)胞凋亡和周期的影響；采用熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測不同濃度Fr2對C6細(xì)胞的Bax、Bcl-2表達(dá)的影響。結(jié)果 MTE的Fr1、Fr2、Fr3均能顯著抑制C6細(xì)胞的增殖（P＜0.05），與陽性對照組5-氟尿嘧啶（5-FU）相比抑制率也較高（P＜0.05），其半數(shù)抑制濃度分別為：60.32、52.30、83.83μg/ml。經(jīng)80、160μg/ml的Fr2處理24 h后，可有效促進(jìn)C6細(xì)胞早期和晚期凋亡（P＜0.05），其周期被阻滯在G2期；Fr2相同方式處理后，C6細(xì)胞中Bax表達(dá)水平分別提高到（124.80±7.68）%和（380.30±6.91）%；Bcl-2表達(dá)水平分別降低到（84.20±3.10）%和（34.20±4.80）%（P＜0.05）。結(jié)論 MTE能夠顯著抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，其中主要有效成分Fr2能夠誘導(dǎo)C6細(xì)胞發(fā)生G2期周期阻滯，并通過影響B(tài)ax和Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)其凋亡。

烏骨藤粗提物 增殖 大鼠膠質(zhì)瘤 C6細(xì)胞

腦膠質(zhì)瘤為常見顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，已報道的44.6%顱內(nèi)腫瘤為腦膠質(zhì)瘤[1]。目前膠質(zhì)瘤的治療手段主要采用手術(shù)配合放化療的綜合治療方式。由于膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，因此，尋找安全、有效的新治療手段是目前迫切需要解決的問題。烏骨藤為蘿藦科牛奶菜屬植物，具有抗腫瘤、平喘、免疫調(diào)節(jié)和降血壓等藥理作用。烏骨藤的粗提物（MTE）為主要成分的藥物“消癌平”臨床上用于治療肝癌、膠質(zhì)瘤、胃癌等惡性腫瘤[2-3]。但由于MTE抗膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制尚不清楚，為進(jìn)一步分離純化烏骨藤，探索其抗膠質(zhì)瘤作用機(jī)制，對推進(jìn)以烏骨藤為主要成分的臨床中藥制劑的減毒增效具有重要價值，筆者采用新型四氮唑鹽法（MTS）檢測不同的MTE組分（Fr1、Fr2、Fr3）對C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率，流式細(xì)胞技術(shù)檢測MTE組分對C6細(xì)胞增殖、凋亡和周期的影響，RT-qPCR技術(shù)檢測MTE組分對C6細(xì)胞中Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，從而探索MTE是否影響膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞及其影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6細(xì)胞系（由浙江省人民醫(yī)院臨床研究中心提供）培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國 Invitrogen公司）中，在37℃、飽和濕度、含5%CO2、100U/ml青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48～72h傳代，采用0.25%胰酶消化，1∶3傳代后，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實驗研究。

1.2 MTS MTE經(jīng)萃取和色譜分離，獲得3個主要有效組分Fr1、Fr2和Fr3（由浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院純化和提供）。將Fr1、Fr2和Fr3溶于二甲基亞砜（DMSO）配成高濃度的儲存液，分別使用20、40、80、160、320μg/ml的MTE處理C6細(xì)胞24h，陽性對照組采用8 000μg/ ml的5-氟尿嘧啶（5-FU）；采用MTS法測定不同濃度MTE對體外培養(yǎng)C6細(xì)胞增殖的影響，并根據(jù)吸光度（OD）值計算細(xì)胞增殖抑制率作圖得到劑量-效應(yīng)圖譜[2]。實驗重復(fù)3次，取3次實驗數(shù)據(jù)的平均值；并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和周期 由于前期工作中已知Fr2組分含較多新的有效單體，選Fr2活性組分先進(jìn)行研究。分別使用 0.10%DMSO、80μg/ml和160μg/ml Fr2處理C6細(xì)胞24h，使用流式細(xì)胞術(shù)（美國BD公司）檢測3組C6細(xì)胞凋亡和周期的差異[3]。

1.4 RT-qPCR檢測 分別使用0.10%DMSO、80μg/ml和160μg/ml的Fr2處理C6細(xì)胞24h，抽提總RNA（美國Invitrogen公司），以50ng作為模板，使用RT-qPCR法，以SYBR Green I作為染料。滴加20μl反應(yīng)液（表1），對Bax、Bcl-2表達(dá)水平進(jìn)行檢測。以DMSO組為參照獲得循環(huán)閾值（Ct），計算MTE組Bax、Bcl-2表達(dá)水平的變化，引物序列詳見表2。

表1 RT-qPCR反應(yīng)體系的配置（μl）

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Prizm 5統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

表2 RT-qPCR法引物序列

2 結(jié)果

2.1 MTE對抑制C6細(xì)胞增殖的影響 Fr1、Fr2、Fr3組分C6細(xì)胞的IC50分別為60.32、52.30、83.83μg/ml。20、40、80、160和320μg/ml MTE和陽性對照組抑制率[（26.15±1.19）%]均高于0μg/ml MTE組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且隨MTE濃度的升高，其抑制率逐漸增強(qiáng)，詳見表3。

表3 MTE對抑制C6細(xì)胞增殖的影響（%）

2.2 MTE中Fr2對C6細(xì)胞周期的的影響 DMSO對照組，G1（72.47±2.36）%，S（21.42±2.55）%，G2（6.10±0.52）%；80μg/ml組，G1（65.12±1.65）%，S（21.75±1.19）%，G2（13.12±1.01）%；160μg/ml組，G1（58.64±1.91）%，S（27.22± 1.92）%，G2（14.14±1.57）%；Fr2組的G1和 G2期與DMSO對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且Fr2組的G2期隨著藥物濃度的升高具有增加趨勢，細(xì)胞被阻滯在G2期，詳見圖1。

2.3 MTE中Fr2對C6細(xì)胞凋亡的影響 DMSO對照組、80μg/ml和160μg/ml Fr2組C6細(xì)胞的早期凋亡率分別為（4.77±0.88）%、（5.91±0.56）%、（18.45±0.85）%；晚期凋亡率分別為（3.90±0.12）%、（7.68±1.05）%、（31.07±1.80）%；與DMSO對照組比較，F(xiàn)r2組的早期凋亡率和晚期凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)r2組的凋亡率隨著Fr2濃度提高而提高（P＜0.05），詳見圖2。

2.4 Fr2對Bax和Bcl-2表達(dá)水平的影響 DMSO處理后Bax、Bcl-2的Ct值分別為22.02±0.28和27.72± 0.41，標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)80、160μg/ml Fr2處理，C6細(xì)胞的Bax表達(dá)水平提高到（124.80±7.68）%、（380.30±69.10）%，Bcl-2表達(dá)水平減低到（84.20±3.10）%、（34.20±4.80）%（均P＜0.05）。

圖1 MTE中Fr2對C6細(xì)胞周期的影響（A：DMSO對照組；B：Fr2 80μg/ml MTE組；C：Fr2 160μg/ml MTE組）

圖2 MTE中Fr2對C6細(xì)胞凋亡的影響（A：DMSO對照組，B：Fr2 80μg/ml Fr2組，C：Fr2 160μg/ml Fr2組）

3 討論

腦膠質(zhì)瘤易轉(zhuǎn)移，易產(chǎn)生耐藥，是中樞神經(jīng)發(fā)病率最高的腦腫瘤。目前，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療不能完全按照常規(guī)腫瘤治療方式，這是因為膠質(zhì)瘤生長在一個相對分化成熟的區(qū)域，且受到血腦屏障的保護(hù)，常規(guī)化療藥物很難到達(dá)膠質(zhì)瘤部位，這在很大程度上限制了膠質(zhì)瘤的治療。低毒高效的天然小分子藥物易于穿透血腦屏障，而表現(xiàn)出獨特的治療優(yōu)勢[4-5]。

烏骨藤是一類蘿藦科牛奶菜屬植物，具有止咳平喘、養(yǎng)胃散結(jié)之效，既往常用于保肝利尿藥效的應(yīng)用。近年來，有學(xué)者提出，烏骨藤在免疫調(diào)節(jié)、敗毒抗癌中的功效有望應(yīng)用于各類惡性腫瘤的治療，并在臨床研究中證實了其聯(lián)合放化療的良好效果[6]。然而，目前關(guān)于烏骨藤對于癌細(xì)胞的作用機(jī)制研究尚不深入。故本研究中，采用烏骨藤提取物在體外實驗中研究它們對大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖有無抑制作用，對腫瘤的凋亡有無促進(jìn)作用，期望為今后開發(fā)治療腫瘤藥物奠定實驗基礎(chǔ)。

本研究應(yīng)用自己提純的MTE作用于C6細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，不同MTE組分對C6細(xì)胞IC50均明顯低于陽性對照，其中Fr2組分抑制效果最好，隨著Fr2組分作用時間、濃度的提高，C6細(xì)胞增殖能力抑制越明顯，細(xì)胞的核分裂象減少程度也更明顯，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Fr2組分處理后，C6細(xì)胞的G1期顯著減少，而G2期受到了明顯阻滯，且隨著濃度的提高早期和晚期凋亡加劇。qPCR實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)Fr2組分處理后C6細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)水平顯著下調(diào)，且隨濃度提高而下降；Bax的表達(dá)水平顯著上調(diào)，隨Fr2組分濃度提高而提高。眾所周知，癌基因Bcl-2由于染色體易位(14，18)導(dǎo)致14號染色體上的免疫球蛋白重鏈基因（IgH）與18號染色體上的Bcl-2的融合[7]，從而使Bcl-2過表達(dá)，通過將細(xì)胞阻滯在G0/G1期而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤生長和演進(jìn)[8]。而Bax相反，它的表達(dá)提高阻礙腫瘤進(jìn)展及惡性轉(zhuǎn)化，這體現(xiàn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源的腫瘤在生物學(xué)行為及臨床上的多樣性[9]。通過抑制Bcl-2和提高Bax的表達(dá)量，解除G1其阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而這一結(jié)果與流式檢測細(xì)胞周期與凋亡的現(xiàn)象一致，進(jìn)一步明確MTE抑制C6細(xì)胞的作用機(jī)制。同時，細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)有助于機(jī)體正常內(nèi)環(huán)境的恢復(fù)與穩(wěn)定，凋亡抑制基因的高表達(dá)以及促凋亡基因的突變或表達(dá)降低被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和增殖的重要原因，在抑制腫瘤形成、降低其生長速度及改善患者預(yù)后方面均有著重要意義[10]。

綜上所述，烏骨藤制劑能夠明顯抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞Bax，Bcl-2的表達(dá)，提示烏骨藤制劑將有可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤的目的。該研究對于篩選有益的傳統(tǒng)中藥抗癌成分，豐富中藥的藥理理論具有重要的意義，對今后科學(xué)提取和使用烏骨藤抗腫瘤活性成分具有指導(dǎo)價值，有待更深入的研究。

[1] Yonehara S,Brenne AV,Kishikawa M,et al.Clinicaland epidemiologic characteristics offirst primary tumors of the centralnervous system and related organs among atomic bomb survivors in Hiroshima and Nagasaki,1958-1995[J].Cancer,2004,101(7):1644-1654.

[2] Huang T,Gong WH,Zou C P,et al.Marsdenia tenacissima extract sensitizes MG63 cells to doxorubicin-induced apoptosis[J].Genetics and molecular research:GMR,2014,13(1):354-361.

[3] 張銳,劉靜,劉陽晨,等.烏骨藤制劑誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞Bel-7402凋亡的實驗研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013,21(3):488-491.

[4] 張珂,馬勝林.天然藥物抗腫瘤機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志, 2011,26(10):2344-2347.

[5] Shao J,Zheng D,Jiang Z,et al.Curcumin delivery by methoxy polyethylene glycol-poly(caprolactone)nanoparticles inhibits the growth of C6 glioma cells[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2011,43(4):267-274.

[6] Han S Y,Ding H R,Zhao W,et al.Enhancement of gefitinib-induced growth inhibition by Marsdenia tenacissima extract in non-smallcelllung cancercells expressing wild ormutantEGFR[J]. BMCComplementaryand Alternative Medicine,2014,14(1):165.

[7] Hou Q,Cymbalyuk E,Hsu S C,et al.Apoptosis modulatory activities of transiently expressed Bcl-2:roles in cytochrome C release and Bax regulation[J].Apoptosis,2003,8(6):617-629.

[8] Prayson R A.Cyclooxygenase-2,Bcl-2,and chromosome 1p analysis in protoplasmic astrocytomas[J].Hum Pathol,2004,35(3): 317-321.

[9] Jiang Z,Zheng X,Rich KM.Down-regulation of Bcl-2 and Bcl-xl expression with bispecific antisense treatment glioblastoma cell lines induce celldeath[J].Neurochem,2003,84(2):273-281.

[10] Zhang L,Chen F Y,Xu S F,et al.Steroidalaglycones from stems of Marsdenia tenacissima that inhibited the hedgehog signaling pathway[J].Naturalproductcommunications,2014,9(2):155-156.

Effect of Marsdenia tenacissima extract on proliferation of rat C6 glioma cells in vitro

WANG Zhen,LI Kaiqiang,CHEN Bingyu,et al.
Department of Blood Transfusion,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

Objective To investigate the effect of Marsdenia tenacissima extract(MTE)on proliferation of rat glioma C6 cells. Methods A new tetrazolium salt reduction method(MTS)was used to measure the effect of Fr1,Fr2,Fr3 component from MTE on C6 cell proliferation,flow cytometry was applied to measure cell apoptosis and cell cycle,real-time quantitative PCR(qPCR)was used to detect Bax and Bcl-2 gene expression in C6 cells treated by Fr2 with different concentrations. Results Fr1,Fr2 and Fr3 of MTE significantly inhibited the proliferation of C6 cells(P＜0.05),the inhibition rate was higher than that of 5-fluorouracil(5-FU)(P＜0.05),and the 50%inhibitory concentrations were 60.32μg/ml,52.30 μg/ml,and 83.83μg/ml,respectively.After treated with 80 μg/ml and 160μg/ml of Fr2 for 24h,early and late apoptosis of C6 cells were both promoted(P＜0.05),and the cell cycle was arrested at G2phase;Bax gene expression was increased to (124.80± 7.68)%and(380.30±6.91)%;Bcl-2 gene expression was reduced to(84.20±3.1)%and(34.20±4.80)%,respectively(P＜0.05). Conclusion This study suggests that MTE can significantly inhibit the proliferation of C6 glioma cells, and the main active ingredient Fr2 can induce G2phase cycle arrest and promote apoptosis,which were associated with changes of Bax and Bcl-2 gene expression.

Marsdenia tenacissima extractProliferation Rat glioma C6 cell line

2015-01-05）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省自然科學(xué)基金（LY15H280003、LY15C090004）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2014ZB007、2014ZQ005）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院輸血科（王震、李凱強(qiáng)、陳秉宇、郝珂），臨床研究中心（何徐軍、牟曉洲、陶厚權(quán)），胃腸外科（張威）；浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院（應(yīng)優(yōu)敏）

，張威，E-mail：mmizjpph88@163.com