余劍琴 徐云升 歐榮英 張乾 鄭飛云
HPV18 E7抗原T細(xì)胞表位的鑒定及CD4+T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)
余劍琴 徐云升 歐榮英 張乾 鄭飛云
目的 初步鑒定人乳頭瘤病毒(HPV)18型E7抗原的輔助T淋巴細(xì)胞(Th)表位及CD4+T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)。方法 以免疫磁珠進(jìn)一步分離HLA-DRB1*0301陽性健康人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中的CD4+T淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞純度,用之前實(shí)驗(yàn)中已獲得的3個(gè)HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位刺激外周血CD4+T淋巴細(xì)胞,用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)檢測CD4+T淋巴細(xì)胞增殖活性。ELISA方法分析表位刺激CD4+T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。結(jié)果 多肽P1(HPV18 E780-94)在體外刺激CD4+T淋巴細(xì)胞后能夠有效誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖,P1組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),多肽P1(HPV18 E780-94)刺激CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ,P1組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 P1(HPV18 E780-94)可能為HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位。
人乳頭瘤病毒 E7抗原 CD4+T淋巴細(xì)胞 Th表位
宮頸癌是女性最常見的的惡性腫瘤之一,發(fā)病率居女性癌癥的第2位,死亡率居女性癌癥的第3位[1]。2012年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)確定了導(dǎo)致宮頸癌的12種人乳頭瘤病毒(HPV)基因型,HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58和HPV59,而HPV18是世界大部分地區(qū)宮頸癌患者中次于HPV16的第2位常見高危HPV,HPV18較HPV16具有更強(qiáng)的惡性轉(zhuǎn)化能力,與宮頸腺癌顯著相關(guān),利用其制備的疫苗可能對腫瘤具有治療作用[2]。我們在前期研究中采用SYFPEITHI預(yù)測軟件,對靶抗原HPV18 E7的HLA-DRB1*0301限制性Th表位進(jìn)行預(yù)測及預(yù)測肽合成、純化及質(zhì)譜鑒定,用合成的多肽在體外刺激人外周血單核細(xì)胞(PBMC),結(jié)果表明預(yù)測獲得的其中1個(gè)候選表位能刺激淋巴細(xì)胞增殖[3-4]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證候選表位是否能刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖,我們進(jìn)一步進(jìn)行了CD4+T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)并檢測其極化方向,為進(jìn)一步研制HPV18治療性表位疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 材料 由Genbank獲得的HPV18 E7抗原由105個(gè)氨基酸組成,其序列見文獻(xiàn)[4]。將HPV18E7抗原氨基酸序列輸入SYFPEITHI網(wǎng)站工作,篩選并合成出3條HLA-DRB1*0301限制性多肽,P1(80-94)ADDLRAFQQLFLNTL,P2(72-86)IELVVESSADDLRAF,P3(18-32)QNEIPVDLLCHEQLS,分離HLA-DRB1*0301陽性健康人PBMC,為本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備,詳見文獻(xiàn)[4]。
1.2 試劑 Dynal CD4+T淋巴細(xì)胞陰性分選試劑盒及Dynal MPC-15磁性分離架購自挪威Dynal公司,5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)購自德國Roche公司,流式細(xì)胞儀由美國Becton Dickinson公司生產(chǎn)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 Dynal免疫磁珠分離CD4+T淋巴細(xì)胞及純度鑒定使用Dynal CD4+T淋巴細(xì)胞陰性分選試劑盒分離PBMC,分離后所得CD4+T淋巴細(xì)胞用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)并鑒定純度,分析軟件為Cell Quest V3.2。同時(shí)檢測分離前后CD4+T淋巴細(xì)胞活力。
1.3.2 CD4+T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證P1、P2、P3三個(gè)多肽是否能刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行了CD4+T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。(1)輔助細(xì)胞的處理:將分離得到的PBMC接種于25ml培養(yǎng)瓶中,37℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后經(jīng)直線加速器照射(30Gy)去增殖,作為抗原遞呈細(xì)胞(APC)。(2)CD4+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng):調(diào)整CD4+T淋巴細(xì)胞濃度為2×106/ml,PBMC濃度為4×106/ml,于96孔平底培養(yǎng)板,每孔加入CD4+T淋巴細(xì)胞2×105、照射過的PBMC 2× 105,同時(shí)分別加入稀釋好的合成多肽P1、P2、P3各10μg/ml(下文簡稱P1組、P2組、P3組);陰性對照孔只加稀釋液,不含合成多肽(NC組);陽性對照孔加入植物血凝素(PHA),終濃度10μg/ml;空白孔為不含細(xì)胞的IMDM培養(yǎng)液;同時(shí)設(shè)立CD4+T淋巴細(xì)胞加合成多肽(P1、P2、P3)及APC加PHA的對照孔,終體積為200μl。每組做3個(gè)平行孔,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d,培養(yǎng)結(jié)束前24 h加入BrdU20μl。用酶標(biāo)儀測定吸光度(OD)值,OD值=實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對照組OD值。
1.3.3 ELISA法檢測細(xì)胞因子 為了分析篩選出的表位肽誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,采用ELISA法檢測多肽與CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子。將CD4+T細(xì)胞懸液調(diào)成細(xì)胞濃度為1×106/ml,經(jīng)照射的PBMC懸液調(diào)成細(xì)胞濃度為1×106/ml;各取100μl鋪于24孔培養(yǎng)板,加入合成多肽(10μg/ml),總體積0.5ml/孔;陰性對照孔只加稀釋液,不含合成多肽。每組做3個(gè)平行孔,37℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后離心,1 500r/min,5min,收集細(xì)胞懸液400μl置入Eppendorf管,上清液用ELISA法測定細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10和IL-4表達(dá)情況。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以表示,組間比較采用方差分析。
2.1 CD4+T淋巴細(xì)胞純度 用PE標(biāo)記的抗人CD3和FITC標(biāo)記的抗人CD4加入PBMC分離前后試管,經(jīng)流式細(xì)胞分析,可見分離前CD4+T淋巴細(xì)胞純度為45.25%,分離后的純度達(dá)到90.71%以上,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。
2.2 細(xì)胞懸液中CD4+T淋巴細(xì)胞的活力 臺盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及死細(xì)胞數(shù),計(jì)算細(xì)胞活力,免疫磁珠分離前后CD4+T淋巴細(xì)胞的活力分別為(96.15±2.36)%及(94.32±3.11)%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.3 CD4+T淋巴細(xì)胞增殖情況 分離的CD4+T淋巴細(xì)胞與照射后的PBMC及合成多肽共同培養(yǎng),結(jié)果顯示P1能刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖,NC組與P1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PBMC在此作為APC輔助多肽刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖,經(jīng)直線加速器照射可以抑制其增殖,用PHA刺激照射的PBMC(即APC)不能使其增殖。APC+PHA組及未經(jīng)照射PBMC+PHA組OD值分別為0.228±0.010、0.930±0.045,兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說明體系中增殖的細(xì)胞為CD4+T淋巴細(xì)胞;在CD4+T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)時(shí)同時(shí)還設(shè)立了CD4+T淋巴細(xì)胞加抗原的對照,發(fā)現(xiàn)在缺乏APC的情況下CD4+T淋巴細(xì)胞也不能增殖;P1(CD4++PBMC+多肽)組與CD4++P1多肽組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明多肽刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖需要APC的輔助,而不是非特異性的刺激反應(yīng)。詳見圖2。
2.4 ELISA法檢測多肽刺激淋巴細(xì)胞增殖后的細(xì)胞因子表達(dá)情況 P1能刺激CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ,P1組與NC組及P2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),P1組與P3組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而P1、P2、P3組與NC組比較,IL-10、IL-4水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),詳見圖3。此結(jié)果表明P1能刺激Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。
圖1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定免疫磁珠分離前后CD4+T淋巴細(xì)胞的純度(A:分離前;B:分離后)
圖2 不同多肽刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果的比較
高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的始動(dòng)因子,宮頸癌的發(fā)生要經(jīng)過一個(gè)較長的癌前病變階段,在這個(gè)階段可通過免疫學(xué)手段來幫助清除體內(nèi)病毒,這就需要尋找HPV治療性疫苗。其中合成多肽疫苗安全,容易儲存和處理,有理想的靶特異性,是一類很有潛力的疫苗。目前對HPV16治療性多肽疫苗研究較多,而37%~41%的宮頸腺癌是由感染HPVl8引起[5],因此,目前HPV18疫苗的研制和開發(fā)正日益受到關(guān)注。Th表位是外源蛋白經(jīng)APC處理后與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合并提呈到細(xì)胞表面供CD4+T淋巴細(xì)胞識別的短肽,其引發(fā)的CD4+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答對于輔助B細(xì)胞及CTL發(fā)揮效應(yīng)具有重要作用。本研究結(jié)果也顯示,多肽刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖需要APC的輔助,而不是非特異性的刺激反應(yīng)。
圖3 不同多肽刺激CD4+T淋巴細(xì)胞增殖后細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果的比較
Zhao等[6]以重組痘苗病毒rVVJ18 E7、E6多肽分別免疫C57BL/6和BALB/c小鼠,檢測其所誘發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng),結(jié)果表明重組痘苗病毒rVVJ18 E7、E6免疫的兩種品系小鼠均可測到E6肽庫刺激產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng),篩選確定2種多肽為CD8的T細(xì)胞表位。本研究結(jié)果顯示,通過體外HPV18E7抗原多肽刺激CD4+T淋巴細(xì)胞,可檢測到細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌,根據(jù)此文獻(xiàn)可進(jìn)一步做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
以往有關(guān)HPV治療性多肽疫苗的研究主要是針對HLA-A2限制性CTL表位開展的。Ramos等[7]在體外試驗(yàn)中,給予由11個(gè)氨基酸組成的HPV16 E6/E7抗原肽(來自多肽庫)刺激68例HPV相關(guān)腫瘤患者的PBMC及PBMC衍生的樹突狀細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)HPV16 E6/E7能誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生特異性的CTL增殖,并能夠分泌IFN-γ及IL-6等細(xì)胞因子,以上結(jié)果表明,HPV16 E6/E7多肽抗原在體外能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng),與本研究的結(jié)果一致。
近年的研究策略已開始關(guān)注CD4+T淋巴細(xì)胞對HPV感染的影響。Zwaveling等[8]的研究表明,CpGDNA同HPV16 E743-77(含有H-2Kb限制性CTL表位HPV16 E749-57及Th表位E748-54)35肽合用,可使10只宮頸癌移植瘤小鼠中的8只腫瘤完全消退,另2只小鼠的腫瘤生長也較對照組緩慢,而CpGDNA同HPV16 E749-57肽合用僅能使9只宮頸癌移植瘤的小鼠中的3只腫瘤完全消退。Kim等[9]將巴氏涂片異常而行陰道鏡組織活檢的患者分為兩組,一組是活檢為CIN1,2,3為persistors組(n=51),另一組是活檢正常為regressors組(n=33),檢測INF-r、Tregs,結(jié)果表明regressors組CD4+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)比persistors組高,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。以上研究結(jié)果說明CD4+T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)在腫瘤免疫中起關(guān)鍵性作用。本研究結(jié)果顯示,多肽P1(HPV18 E780-94)在體外刺激CD4+T淋巴細(xì)胞后能夠有效誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖,為今后以表位為基礎(chǔ)的HPV疫苗設(shè)計(jì)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
本研究選用BrdU比色法。BrdU與胸腺嘧啶具有結(jié)構(gòu)的相似性,能代替胸腺嘧啶摻入S期細(xì)胞新合成的DNA鏈內(nèi)。近年來進(jìn)一步證實(shí),3H-TdR和BrdU所標(biāo)記的S期細(xì)胞結(jié)果完全一致,但BrdU更具有省時(shí)、簡便、重復(fù)性好和無放射性等優(yōu)點(diǎn),BrdU具有更高的敏感性和可重復(fù)性。本研究采用淋巴細(xì)胞功能試驗(yàn)驗(yàn)證的方法鑒定出HPV18 E7抗原Th表位。在預(yù)測獲得的3條多肽中,經(jīng)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)證實(shí)P1能刺激淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果表明,經(jīng)P1刺激后CD4+T淋巴細(xì)胞的比例較培養(yǎng)前以及未加多肽刺激的對照組均有明顯增加,未加多肽刺激的對照組相對培養(yǎng)前無明顯增加。同時(shí)經(jīng)細(xì)胞因子檢測,可以得出HPV18 E780-94能誘導(dǎo)活化CCD4+T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ。
綜上所述,本研究初步證實(shí)E780-94是HPV18E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th1表位,為今后評價(jià)E7蛋白的細(xì)胞免疫效果提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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Identification of specific T lymphocyte epitope on E7 antigen of human papillomavirus type 18 and CD4+T-cell response
YU Jianqin, XU Yunsheng,OU Rongying,et al.
Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000,China
Objective To identify specific T lymphocyte epitope on E7 antigen of human papillomavirus type 18 and CD4+T-cell responses. Methods Three epitope candidates of human papillomavirus 18 E7 antigen(P1,P2 and P3)were obtained previously.Peripheral blood mononuclear cell(PB MC)from HLA-DRB1*0301-positive healthy donors were prepared and CD4+T cells were separated by Dynal Immunomagnetic beads isolation.The purity was determined by flow cytometry.The predicted peptides were scored as immunogenic ability to stimulate CD4+T cells.Proliferative activity was analyzed with Brdu cell proliferation assay.The cytokine production of CD4+T cells induced by the peptides was detected by ELISA. Results Peptide P1 (HPV18 E780-94)stimulated proliferation of CD4+T cells and the OD value was significantly higher than that of negative control group(P<0.01).Peptide P1(HPV18 E780-94)also stimulated CD4+T cells to secrete IFN-γ and IFN-γ value was significantly higher than that of negative control group(P<0.01). Conclusion Peptide P1(HPV18 E780-94)can be the HLA-DRB1*0301-restricted Th epitope of human papillomavirus 18 E7 antigen,which provides the basis to evaluate cellular immune response elicited by HPV18 E7 protein based vaccine.
Human papillomavirus E7 antigen CD4+T cells T lymphocyte epitopes
2015-01-21)
(本文編輯:沈叔洪)
國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30500537)
325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(余劍琴、歐榮英、張乾、鄭飛云),皮膚科(徐云升)
鄭飛云,E-mail:ZFY@hosp1.ac.cn