劉鐵楠 吳春濤 蘇鵬宇 李素新 張志婓

華北理工大學，河北唐山 063000

雨 生 紅球藻中蝦 青 素的提取和 穩(wěn) 定性研究

劉鐵楠 吳春濤 蘇鵬宇 李素新 張志婓

華北理工大學，河北唐山 063000

目的以雨生紅球藻為原料，研究有機溶劑提取蝦青素的條件及其穩(wěn)定性。方法通過試驗選取乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、無水乙醇和二氯甲烷∶丙酮（2∶1）為提取溶劑，研究不同提取溶劑對蝦青素提取效果的影響；應用試驗得到的最佳溶劑分別于 20、30、40、50、60、70、80℃下提取蝦青素，確定最佳提取溫度；在所得到的最適溫度和溶劑下分別提取 1、1.5、2、2.5、3 h 確定最佳提取時間；設定提取次數(shù)分別為 1、2、3 次，提取后測定其OD480，研究提取次數(shù)對蝦青素提取效果的影響；采用上述實驗中優(yōu)選出的提取溶劑、溫度和時間，料液比分別取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，1∶30、1∶35、1∶40，提取完成后測定其OD480，考察不同料液比對總蝦青素提取率的影響。 測定蝦青素提取液在不同光照（自然光、日光、避光）、溫度（30、40、50、60、70、80℃）、酸堿度（pH 8～14）等條件下的吸光度，以研究蝦青素的穩(wěn)定性。結果蝦青素的提取中二次提取可獲得 90%蝦青素，當料液比為 1∶25 時所測吸光值最大；二氯甲烷∶丙酮（2∶1）為最佳提取液。隨光照強度增加以及堿濃度增加，蝦青素的降解增加。60℃以下，溫度對蝦青素的影響較小，60℃以上，蝦青素開始受熱破壞。結論二氯甲烷∶丙酮（2∶1）是最適的提取溶劑，1∶25 為最佳料液比；二次提取后已經(jīng)提取出大部分蝦青素，光照可導致蝦青素的降解，蝦青素對堿不穩(wěn)定；蝦青素在60℃以下比較穩(wěn)定。

雨生紅球藻；蝦青素；丙酮；提?。环€(wěn)定性

蝦青素（圖 1）是 一種具有很 高 經(jīng)濟價 值 和 廣 泛生物活性的類胡蘿卜素，蝦青素的抗氧化能力是 β-胡蘿卜素的 10 倍，是維生素 E 的 500 倍，被稱為“超級維生素 E”[1-2]，在食品、飼料、保健品、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)均有廣泛的應用價值。 雨生紅球藻中蝦青素含量為 1.5%～3.0%，被看作是天然蝦青素 的“濃縮品”，已成為近年來該領域的研究熱點[3]，目前蝦青素的 產(chǎn)量遠遠不能滿足全球市場的需求量[4-8]。

目前工業(yè)上提取蝦青素 最常用的方法為有機溶劑提取法，因為有機溶劑具有容易回收、可以重復利用、成本低以及提取效率高等優(yōu)點[9-16]。 為此，本文選用不同溶劑進行比較，對雨生紅球藻中蝦青素提取物的提取效率進行分析，旨在尋找能夠安全、有效地提取雨生紅球藻中蝦青素的有機溶劑。 另外，還研究了熱、光、pH 值對蝦青素穩(wěn)定性的影響 ，進而得到合理保存蝦青素的條件，以減少在儲藏、運輸和使用過程中的損失。

圖1 蝦青素（astaxanthin）的分子結構式（C40H52O4）

1 儀器與材料

Waters 2695 高效液相色譜儀（美國 Waters 公司），Unico UV-2000 紫外檢測（美國尤尼柯 unico 公司），KL-UP-III-80 超純水 機（成都唐 氏康寧科技 發(fā)展有限公司），PS104S 電子分析天平（德國 Sartorius），SB-100DT 超聲波清洗儀（太原儀誠實驗室設備有限公司），THZ-92A 氣浴恒溫振蕩器（上海博迅）。 雨生紅球藻為單細胞藻。 由青島綠萃生物科技有限公司提供實驗材料（批號 08K0301）。 二氯甲烷、甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 蝦青素含量計算方法

應用下列公式計算提取液中蝦青素含量[17]：

C（mg/kg）= 4.6×（OD480-0.638×OD645+0.114×OD663）×稀釋倍數(shù)

其中，C 為雨生紅球藻中蝦青素的質(zhì)量濃度（mg/kg）；OD480、OD645、OD663分 別 為 提 取 液 在 480、645、663 nm下的吸光度數(shù)值；稀釋倍數(shù)為提取液最終的體積（mL）與稱取的雨生紅球藻藻粉（冷凍干燥并低溫破碎）質(zhì)量（g）之比。

2.2 蝦青素的提取

2.2.1 蝦青素提取溶劑的確定 選取乙酸乙酯、 丙酮、二氯甲烷、無水乙醇和二氯甲烷∶丙酮（2∶1）為提取溶劑，研究不同提取溶劑以及混合溶劑之間不同比例對蝦青素提取效果的影響，應用 UnicoUV-2000 測定其各吸光度值，以選取最佳的提取溶劑。在 480 nm 處測量吸光度，在幾種溶劑提取物中，二氯甲烷提取物是最高的，同時其在 645、663 nm 下的吸光度也最高，所以不能斷定運用二氯甲烷對蝦青素進行提取是效率最高的，而二氯甲烷∶丙酮（2∶1）的提取液在 480 nm下所測量的吸光值低于二氯甲烷提取液但高于其他有 機 溶 劑 提取 液 的 吸 光 值 ， 且 它 在 645、663 nm 下的吸光度與其他有機溶劑提取液相差并不大，因此可以判定利用二氯甲烷∶丙酮（2∶1）作為溶劑提取蝦青素的效率最高。 見表 1。

表1 不同溶劑蝦青素提取液的吸光度值

2.2.2 提取溫度對提取效果的影響 取 5 份藻液各 2 mL，加入適量“2.2.1”所得的最佳提取溶劑，分別于 20、30、40、50、60、70、80℃下提取蝦青素。 實驗中設置 3個平行樣，提取完成后于 480 nm 波長處測量各樣品吸光度。 分析可得，溫度 60℃時，吸光度最大，因而選60℃為最適提取溫度。 見圖 2。

圖2 不同提取溫度下蝦青素的提取效果比較

2.2.3 最佳提取時間的確定 取 5 份藻液各 2 mL，采用“2.2.1”中優(yōu)選出的提取溶劑，在“2.2.2”所得最適溫度下分別提取 1、1.5、2、2.5、3 h，實驗中設置 3 個平行樣，480 nm 波長下測其吸光度。 研究發(fā)現(xiàn)，雨生紅球藻隨著浸提時間的延長，其在 1～2 h 時提取液的吸光值明顯增加，在 2 h 后略有下降。 故選取提取時間為2 h。 見圖 3。

圖3 不同浸提時間下蝦青素的提取效果

2.2.4 提取次數(shù)的確定 取 5 份藻液各 2 mL，采用上述實驗所得的最優(yōu)提取溶劑、提取溫度和時間進行蝦青素的提取，提取完成后離心收集上清液，藻渣重復上述步驟。 設定提取次數(shù)分別為 1、2、3 次，以 3 次有機溶劑提取蝦青素量總和計為 100%，實驗中設置3 個平行樣，提取后測定其OD480，研究提取次數(shù)對蝦青素提取效果的影響。 研究發(fā)現(xiàn)，提取 3 次的蝦青素提取百分比分別為 79.57%、12.24%、8.01%。 2 次提取率大于 90%，因此在雨生紅球藻中提取蝦青素的實際生產(chǎn)中可采用 2 次提取，以達到資源的合理利用，減少浪費。

2.2.5 料液比對提取效果的影響 移取 5 份藻液各 2 mL，采用上述實驗中優(yōu)選出的提取溶劑，溫度和時間，料液比分別取 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，1∶30、1∶35、1∶40，提取完成后測定其OD480。 研究結果提示，在 25 倍體積以下時，隨溶劑的增加其提取效率也迅速上升，但之后增加緩慢。 因此，丙酮提取蝦青素的最佳液料比為 1∶25。 見圖 4。

圖4 不同液料比下蝦青素的提取效果

2.3 蝦青素的穩(wěn)定性

2.3.1 光照對蝦青素穩(wěn)定性的影響 將蝦青素提取液分別置于室內(nèi)自然光、日光、避光的條件下，每隔一段時間測定其OD480，并研究不同光照對蝦青素穩(wěn)定性的影響。 研究顯示，日光對蝦青素穩(wěn)定性具有顯著影響（P＜ 0.05），連續(xù)日光照射雨生紅球藻提取液大約4 h 蝦青素就會遭到完全破壞；室內(nèi)自然光條件下，24 h后測定雨生紅球藻丙酮提取液的吸光度顯示蝦青素的殘存率為 70%；避光保存時，蝦青素基本不會遭到破壞。 見圖 5。

圖5 光照對蝦青素穩(wěn)定性的影響

2.3.2 溫度對蝦青素穩(wěn)定性的影響 將雨生紅球藻提取液濃縮后用大豆油溶解，得到的蝦青素色素油盛裝于試管中，分別在 30、40、50、60、70、80℃溫度下，每隔一段時間測定其OD480。 研究發(fā)現(xiàn)，30～60℃對蝦青素的穩(wěn)定性基本沒有影響。 當溫度達到 70℃時，雨生紅球藻提取液吸光度隨著加熱時間延長而逐步下降。 當溫度達到 80℃時雨生紅球藻丙酮提取液吸光度下降趨勢最大。 見圖 6。

圖6 溫度對蝦青素穩(wěn)定性的影響

2.3.3 酸堿度對蝦青素穩(wěn)定性的影響 調(diào)節(jié)雨生紅球藻丙酮提取液的 pH 達到 8～14 分別置于比色管中，于室溫避光靜置 4 h 后在 480 nm 下測定其吸光度。研究顯示，隨著 pH 增大，雨生紅球藻丙酮提取液吸光度明顯下降，說明蝦青素遭到了破壞。 因此蝦青素在堿性溶液中是不穩(wěn)定的，pH 越大，蝦青素被破壞得就越嚴重。 見圖 7。

圖7 酸堿度對蝦青素穩(wěn)定性的影響

3 討論

目前，現(xiàn)代生產(chǎn)中提取蝦青素最常用的方法為溶劑萃取法，雨生紅球藻中的蝦青 素 以脂類 形式 存在 ，而蝦青素中脂類種類繁多且有其他胡蘿卜素類，因此蝦青素的提 取和純化一直是蝦青素大規(guī)模生產(chǎn)的最大難題[19-20]。 本研究以雨生紅球藻為基本原料，通過不同溶劑對比 提取蝦 青 素 ，得出二氯甲烷 ∶丙 酮（2 ∶1） 為蝦青素的最適提取溶劑。 同時研究料液比、提取溫度、提取時間對蝦青素的影響，在料液比為1∶25時所 測吸 光度 最 大 ；2次提取后可提取出大部分蝦青素 ， 效率較高。在測定光、熱、堿對蝦青素穩(wěn)定性的影響中發(fā)現(xiàn)，蝦青素在 光照中不穩(wěn)定，不同光照強度引起蝦青素降解大小順序為避光＜室內(nèi)光＜室外光，因此蝦青素應避光保存為宜；同時發(fā)現(xiàn)游離蝦青素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，濃度越大，降解越嚴重，因此蝦青素提取過程中應選擇合適的堿濃度和皂化時間，以減小堿對蝦青素的降解；溫度在 60℃以下，蝦青素較為穩(wěn)定，而60℃以上，蝦青素開始受熱降解。 因本研究實驗條件所限，未進行驗證 試驗，試驗可能存在一定誤差 ；且樣本量較小，對蝦青素提取過程中對實驗儀器精度和試劑質(zhì)量要求高，因此對于大批量生產(chǎn)提取蝦青素以及提高蝦青素的穩(wěn)定性，尚待進一步研究實施。

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Study on extraction and stability of astaxanthin from Haematococcus pluvialis

LIU Tienan W U Chuntao SU Pengyu LI Suxin ZHA NG Zhifei
North China University of Science and Technology,Hebei Province, Tangshan 063000, China

ObjectiveTo study the conditions and stability of astaxanthin extracted by organic solvent, takingHaematococcus pluvialisas raw materials.MethodsThe ethyl acetate, acetone, methylene chloride, absolute ethyl alcohol and methylene chloride ∶acetone (2∶1) were selected as extraction solvent by experiments, the effect of different extraction solvents for extraction of astaxanthin was studied; the optimum solvent gained from the experiment was used to extract astaxanthin at 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80℃, so as to determine the optimum extraction temperature; under the gained optimum temperature and solvent, the astaxanthin was extracted for 1, 1.5, 2, 2.5, 3 h respectively, so as to determine the optimum extraction time;the extraction times were set as 1, 2, 3 times,OD480was measured after extraction, so as to study the effect of extraction times for extraction of astaxanthin; under the gained optimum solvent, temperature and time in the above experiments,the ratios of material to solvent were taken as 1∶5,1∶10,1∶15,1∶20,1∶25, 1∶30,1∶35,1∶40,OD480was measured after extraction, so as to investigate the effect of different ratios of material to solvent for extraction of astaxanthin. The stability of astaxanthin was researched, and the absorbance of astaxanthin extracting solution was determined at different conditions of light (natural light, sunlight, lucifuge), temperature (30, 40, 50, 60, 70, 80℃), acid-base (pH 8 - 14), and so on.ResultsIn the extraction of astaxanthin, the secondary extraction can obtain 90% of astaxanthin. When the ratio of material to solvent was 1∶25, the measured absorbance was maximum. Methylene chloride∶acetone (2∶1) was the best extracting solution.The degradation of astaxanthin increased with the increase of light intensity and the increase of alkali concentration. Below 60℃, the effect of temperature on astaxanthin was small. Above 60℃, astaxanthin began to be heated and damaged.ConclusionMethylene chloride ∶acetone (2∶1) is best extracting solution, and 1∶25 is the best ratio of material to solvent. the secondary extraction can extract most of astaxanthin, light can lead to degradation ofastaxanthin,astaxanthin is unstable to alkali,astaxanthin is relatively stable below 60℃.

Haematococcus pluvialis; Astaxanthin; Acetone; Extraction;Stability

Q949.9；S986.2

A

1673-7210（2015）08（b）-0025-04

2015-04-03 本文編輯：張瑜杰）

中國煤炭工業(yè)協(xié)會科學技術研究指導性計劃項目（MTKJ2014-286）。