劉 航
遼寧工業(yè)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,錦州 121001
干旱是嚴重的自然災(zāi)害,是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個全球性問題也是制約我國農(nóng)產(chǎn)品提高產(chǎn)量的一個重要因素之一。持續(xù)的干旱脅迫會引發(fā)植物一系列生化和生理響應(yīng),包括植株生長抑制、細胞氧化損傷及光合抑制,最終導(dǎo)致小麥生長發(fā)育受到影響[1-4]。葉綠素是高等植物光合作用主要組成成分,葉綠素合成受阻會嚴重影響植物生長發(fā)育。某種程度上來說,葉綠素含量的改變反映了植物的健康程度[5]。干旱脅迫會誘導(dǎo)植物脯氨酸積累。脯氨酸作為滲透脅迫保護劑參與植物抗旱,且緩解滲透脅迫對植物造成的損傷[6]。脅迫條件下,超氧化物歧化酶SOD 和過氧化物酶POD 可直接與活性氧ROS 反應(yīng)。細胞膜對各種逆境脅迫非常敏感,通常伴隨著MDA 含量的增加,這是一種細胞膜氧化損傷的典型特征。因此,MDA 含量可以作為干旱脅迫損傷的一個重要指標[7]。隨著干旱脅迫相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn),越來越多的研究將目光集中在ABA 信號通路中。眾所周知,ABA 依賴性信號通路參與干旱脅迫響應(yīng)[8]。缺水條件下,一些由ABA 介導(dǎo)的脅迫響應(yīng)基因被誘導(dǎo),例如如編碼滲透保護蛋白的基因、蛋白激酶等[9,10]。
褐藻膠寡糖(Alginate oligosaccharides,AOS)來源于降解的褐藻膠多糖,由β-D-甘露糖醛酸(ManA)和α-L-古洛糖醛酸(GulA)或二者雜合片段構(gòu)成。褐藻膠寡糖AOS 具有多種植物活性[11]。據(jù)報道,AOS 可以促進植物根系生長[12-14],提高植物產(chǎn)量[15],緩解如高鹽、重金屬等非生物脅迫對植物造成的損傷[16,17],但AOS 對植物抗旱能力影響的研究鮮有報道。
本文考察了褐藻膠寡糖AOS 對小麥生物量、次級代謝產(chǎn)物以及抗氧化酶活性的影響,且研究AOS對ABA 依賴性信號通路中抗旱相關(guān)基因,如LEA1、SnRK2 和NCED 表達的影響。
選用干旱敏感型小麥Xinong979 為供試材料。用75%乙醇浸種10 min 消毒后,再用去離子水浸種8 h。晝/夜循環(huán)12 h/12 h,25 ℃/20 ℃,相對濕度65%,光照強度為800 μmol/(m2·s)。選取生長狀態(tài)比較一致的1 周齡小麥,用聚乙二醇-6000(PEG-6000)模擬滲透,使PEG 終濃度達到20%。在各組處理24 h 后進行取樣以及生理生化指標的檢測。
設(shè)置4 個處理組:空白對照Control(葉面噴施去離子水),脅迫處理組PEG(PEG-6000 灌根+葉面噴施去離子水),寡糖處理組AOS(葉面噴施1,000 mg/L 褐藻膠寡糖溶液),寡糖+脅迫處理組AOS+P(PEG-6000 灌根+葉面噴施1,000 mg/L 褐藻膠寡糖溶液)。
新鮮小麥苗稱取鮮重(FW)后,將葉片浸入到去離子水中飽和2 h,以獲得飽和重量(SW),然后將這些葉片放入烘箱75oC 干燥24 h,以獲得干重(DW)。相對水含量(RWC(%))按照以下公式計算:
稱取新鮮的小麥葉片1 g,用10 mL 95%乙醇勻漿。勻漿后的上清液在665(A665)和649(A649)nm下分別檢測吸光值。葉綠素含量可以按照以下公式進行計算:
脯氨酸含量檢測按照Bates[18]方法。
MDA 含量檢測按照Gao[19]方法。稱取新鮮的小麥葉片1 g,在100 mg/L 三氯乙酸中勻漿,離心后的上清液加入2 mL 硫代巴比妥酸(TBA),沸水浴15 min 冷卻后冰浴。上清液在分別在532 nm、600 nm 和450 nm 波長下測定吸光值。
超氧化物歧化酶SOD 活力按照Giannopolitis[20]的方法。SOD 活性單位以抑制NBT 光化還原的50%為一個酶活性單位表示,單位U/mg FW。
過氧化物酶POD 活性按照Zhang 和Kirham[21]的方法。POD 活性單位以每g 植物鮮重每分鐘內(nèi)A470變化0.01 為一個酶活力單位,單位U/(g FW·min)。
小麥總RNA 提取、cDNA 合成以及RT-PCR 分別按照RNAiso Plus extraction solution 試劑盒(寶生物,大連)、Takara RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0 試劑盒(寶生物,大連)和2 ×Taq PCR MasterMix 試劑盒(博邁德,北京)提供的方法進行。實驗所用引物在表1 中。
褐藻膠寡糖為實驗室自制。褐藻膠(購自青島明月海藻有限公司)利用商品化褐藻膠裂解酶(購自上海Nagase 貿(mào)易有限公司)在45 ℃下降解10 h,利用80%乙醇進行沉淀,除去大分子未降解的多糖以及雜質(zhì),離心15 min 后得到的上清液凍干,制得寡糖。樣本進行HPLC 檢測,產(chǎn)物的聚合度為2~6,主要為2 糖和3 糖。
由圖1 實驗結(jié)果可知,24 h 后與空白對照組相比,PEG 處理的小麥葉片出現(xiàn)萎蔫、生長受到嚴重抑制。與PEG 組相比,施加了1,000 mg/L 的褐藻膠寡糖的小麥苗長、根長以及鮮重分別增加了17.9%、26.2%和43.1%(圖2 A~C),相對水含量RWC(%)則增加了32.7%(圖2 D)。
圖1 褐藻膠寡糖對小麥生長狀態(tài)的影響Fig.1 Effects of AOS on phenotypes of wheat
圖2 褐藻膠寡糖對小麥生長指標的影響Fig.2 Effects of AOS on growth parameters of wheat
圖3 褐藻膠寡糖對小麥葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of AOS on chlorophyll content of wheat leaves
各組處理24 h 后,褐藻膠寡糖AOS 組中小麥葉片中葉綠素含量比其他處理組顯著增高(P>0.05)(圖3),而PEG 處理組小麥葉綠素含量明顯下降;PEG 處理下外源施加1,000 mg/L 褐藻膠寡糖的小麥葉綠素含量是僅用PEG 處理的2 倍。這些現(xiàn)象表明,小麥在正?;蚋珊得{迫條件下,外源施加褐藻膠寡糖對小麥葉綠素合成具有促進作用。植物生長是由碳固定引起的,這反映在葉綠素含量的增加上。從實驗結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn),褐藻膠寡糖能夠使干旱下生長受到抑制的小麥恢復(fù)生長。這可能是由于褐藻膠寡糖通過增加葉綠素含量來緩解植物光合抑制。
圖4 褐藻膠寡糖對脯氨酸和MDA 含量以及抗氧化酶活力的影響Fig.4 Effects of AOS on proline and MDA contents and antioxidase activities of wheat leaves
為了抵御外界非生物脅迫,許多植物通過合成和積累脯氨酸來調(diào)節(jié)滲透壓。在某種程度上,脯氨酸含量的高低可以作為評價植物抗逆能力的指標之一[22]。與空白對照組相比,24 h 后PEG 處理組和褐藻膠寡糖處理組小麥中脯氨酸含量分別增加了36.3%和41.2%。干旱狀態(tài)下,外源施加寡糖的小麥處理組其脯氨酸含量增加了53%(圖4 A)。結(jié)果表明,干旱條件下褐藻膠寡糖能夠通過增加脯氨酸積累,增加小麥葉肉細胞中的滲透調(diào)節(jié)能力,提高小麥抗旱性。
MDA 含量增加是細胞膜損傷的典型特征,因此MDA 含量多少能夠反映出細胞膜氧化損傷的程度。PEG 處理組MDA 含量顯著增加(P<0.05),與之相比施加了1,000 mg/L 褐藻膠寡糖的處理組MDA 含量降低37.9%(圖4 B)。結(jié)果表明,干旱條件下施加褐藻膠寡糖可以緩解小麥細胞膜損傷,降低脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生。
水分缺失和滲透脅迫會造成植物細胞氧化脅迫。植物細胞進化出一種防御機制來抵御活性氧對其造成的損傷。其中一個重要的機制就是抗氧化酶系統(tǒng),包括SOD 和POD[23]。與空白對照組相比,24 h 后PEG 處理的小麥葉片中超氧化物歧化酶SOD的活性增加了7%,施加寡糖后的小麥中超氧化物歧化酶活性也升高(圖4 C)。過氧化物酶POD 的活性也呈現(xiàn)同樣的趨勢(圖4 D)。說明褐藻膠寡糖可以作為外源激發(fā)子,激活抗氧化酶活性。干旱條件下,外源施加褐藻膠寡糖,小麥中超氧化物歧化酶SOD 和過氧化物酶POD 活性分別提高了4% 和13.2%。由實驗結(jié)果可知,褐藻膠寡糖能夠降低脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)的含量,并且可以通過提高抗氧化酶(SOD 和POD)活性緩解葉片細胞氧化損傷。
圖5 褐藻膠寡糖對LEA1 轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 Expression patterns and relative expression level of LEA1
LEA 蛋白對胚乳發(fā)育和植物生長器官的滲透脅迫有保護的作用[24]。圖5 顯示,在非干旱脅迫下,LEA 蛋白基因在植物營養(yǎng)器官中低表達,干旱和AOS 處理均能夠誘導(dǎo)該基因。PEG 處理24 h 后小麥植株嚴重脫水,為了保護植物生長器官,其自身必須大量誘導(dǎo)LEA1 表達,因此出現(xiàn)強烈誘導(dǎo)現(xiàn)象。褐藻膠寡糖誘導(dǎo)小麥LEA1 基因結(jié)果表明:寡糖激發(fā)了LEA1 的轉(zhuǎn)錄,葉片中LEA1 在3 h 就能被褐藻膠寡糖誘導(dǎo),且為較緩和,24 h 達到峰值,之后下降。AOS+P 處理組中,在處理的早期小麥LEA1 就被誘導(dǎo),隨著時間的推移,植株適應(yīng)了這種外源激發(fā)作用,因此該處理組中LEA1 的誘導(dǎo)表現(xiàn)不是那么強烈。
圖6 褐藻膠寡糖對SnRK2 轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.6 Expression patterns and relative expression level of SnRK2
SnRK2 編碼蛋白激酶,調(diào)控干旱響應(yīng)基因(轉(zhuǎn)錄因子TFs),TFs 與下游抗旱相關(guān)的基因啟動子中順式作用元件結(jié)合,啟動基因表達。從圖6 中可知,除了空白對照組,所有的處理組中SnRK2 的表達都是先升后降的趨勢。PEG 處理組小麥中SnRK2 基因12 h 時達到最大。褐藻膠寡糖可以在早期快速誘導(dǎo)SnRK2:在葉片中該基因3 h 開始上調(diào)。在植物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間存在聯(lián)系和交叉作用。SnRK2 編碼的蛋白激酶參與了逆境脅迫下的很多信號通路:例如,ABA-依賴性信號通路、ABA-非依賴型信號通路以及水楊酸信號通路等,可以說SnRK2 蛋白激酶是信號通路中眾多樞紐之一[25]。當(dāng)激發(fā)子AOS 和PEG 同時作用時,很有可能是幾條通路同時響應(yīng),對于SnRK2 需求必然要比單獨使用PEG 和AOS 處理要大,因此在實驗結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn),PEG和AOS 同時誘導(dǎo)該基因具有疊加效果,可使SnRK2轉(zhuǎn)錄水平比單獨用PEG 或AOS 處理提高2 倍左右。以上結(jié)果表明,褐藻膠寡糖不僅能在早期快速調(diào)控功能基因(LEA1)而且能夠刺激調(diào)控基因(SnRK2)表達,增強小麥抗旱能力。
圖7 褐藻膠寡糖對NCED 轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.7 Expression patterns and relative expression level of NCED
9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxy carotenoid dioxygenase,NCED)催化的氧化裂解反應(yīng)是ABA 生物合成途徑中的關(guān)鍵步驟。NCED 基因參與了麥類作物的非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng),并調(diào)控內(nèi)源ABA 的合成。由圖7 可知,干旱和AOS 均可誘導(dǎo)NCED 基因,用于合成脫落酸。干旱條件下使用褐藻膠寡糖,葉片中該基因表達出現(xiàn)“波動”,3 h 時表達出現(xiàn)一個小高峰,而后下降,72 h 時又出現(xiàn)一個更高的表達,出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是因為一開始外界環(huán)境對植物造成刺激,為了應(yīng)對這種急劇的變化,植物對刺激迅速作出反應(yīng),基因表達量驟然升高;當(dāng)植物逐步適應(yīng)該變化后,表達又下降;到了干旱脅迫后期,植株受到的損傷更加嚴重,為了抵抗外界環(huán)境對其造成的侵害,使脅迫響應(yīng)基因的表達又達到一個更高的水平。
研究結(jié)果表明,褐藻膠寡糖AOS 能夠提高小麥生物量、促進植物葉綠素合成??烧T導(dǎo)小麥脅迫保護劑-脯氨酸積累,產(chǎn)生抗逆酶類,清除由于滲透脅迫產(chǎn)生的氧自由基,保護葉綠素和細胞膜結(jié)構(gòu),減少胞內(nèi)物質(zhì)滲漏,降低丙二醛MDA 含量,穩(wěn)定細胞內(nèi)外環(huán)境。此外,褐藻膠寡糖可以快速有效上調(diào)ABA依賴性信號通路中的蛋白激酶編碼基因SnRK2、晚期豐度蛋白編碼基因LEA1 和ABA 從頭合成酶基因NCED 的表達,表明AOS 可能參與了ABA 依賴性信號通路來緩解干旱對小麥的脅迫作用,增強小麥抗旱能力。
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