楊艷紅，李世川，蘭世玉，朱 巍

重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院生物工程系，重慶 400054

α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)以隨機作用方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的α-1，4 糖苷鍵，生成糊精、低聚糖和單糖，廣泛用于糧食加工、釀造、紡織品、制藥、飼料、石油開采等行業(yè)［1］，在工業(yè)生產(chǎn)中占有極其重要的地位。目前，工業(yè)上，都是采用微生物發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)α-淀粉酶，是用途較廣泛的一種酶制劑，占據(jù)了整個酶制劑市場份額的25%左右［2，3］。

目前，國內(nèi)外市場中常用的中溫和高溫α-淀粉酶的適用pH 范圍一般為6.0～8.0，在酸性條件下其酶活性明顯降低，已不能滿足一些酸性條件下淀粉原料的深加工工藝的要求［4，5］。如我國淀粉原料的深加工過程一般需要經(jīng)過液化和糖化，液化過程中使用的淀粉酶其最適的pH 在6.0 左右，但在隨后的糖化過程中，糖化酶的最適pH 在5.0 左右，這就會出現(xiàn)在淀粉液化后要耗費大量酸堿來調(diào)pH，而耐酸性淀粉酶的開發(fā)將有助于解決液化酶和糖化酶最適pH 存在差異的這個難題。耐酸性α-淀粉酶是一類可以在較低pH 值條件下水解淀粉的酶類，最適pH 一般為4.0～5.5［6］，可使淀粉原料深加工工藝中的液化和糖化在同一pH 條件進行，進而簡化工藝，節(jié)約成本。另外，耐酸性α-淀粉酶還可以用于高麥芽糖漿的生產(chǎn)、開發(fā)新型助消化劑以及工業(yè)廢液處理等多個領(lǐng)域，能有效減少加工工藝過程中化學(xué)試劑的消耗［7］，降低副產(chǎn)物的形成，減少環(huán)境污染，具有重大經(jīng)濟、社會效益［2］。

解淀粉芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，脂肪嗜熱芽孢桿菌在工業(yè)生產(chǎn)中被認(rèn)為是最好的α-淀粉酶生產(chǎn)菌株［8］。本文主要對實驗室分離的一株產(chǎn)高活性酸性α-淀粉酶的野生菌株進行鑒定和酶學(xué)性質(zhì)研究，以期為該酸性α-淀粉酶的工業(yè)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

AF1，本實驗室分離。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

生長培養(yǎng)基:馬鈴薯20.0 g，蔗糖3.0 g，蛋白胨2.5 g，尿素0.33 g，NaCl 1.0 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯20.0 g，蔗糖2.0 g，蛋白胨3.0 g，尿素0.33 g，NaCl 1.0 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0。

菌種鑒定培養(yǎng)基:參見《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［9］。

Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR 9164 購自Takara(日本);16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit RR176 購自Takara(日本);Takara MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 購自Takara(日本)。

1.3 分離菌株的鑒定

1.3.1 生理生化鑒定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［9］和《現(xiàn)代微生物學(xué)實驗技術(shù)》［10］進行。

1.3.2 16S rDNA 序列測定

把AF1 培養(yǎng)至對數(shù)期，嚴(yán)格按照Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164，Takara)操作說明進行操作，獲得含基因組DNA 的裂解液，然后以裂解液為模板，按Takara 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176，Takara)進行PCR 反應(yīng)，PCR 產(chǎn)物用Takara MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0(Code No.9761，Takara)進行回收純化。純化產(chǎn)物送Invitrogen 公司進行全序列測序。測序引物Seq forward、Seq internal 和Seq reverse 來自于Takara 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176，Takara)。將序列通過NCBI 網(wǎng)站中的BLAST 程序與GenBank 中的核酸數(shù)據(jù)進行對比分析。根據(jù)比對結(jié)果，從數(shù)據(jù)庫中選取與所分析的細菌基因序列同源性較高的已知相關(guān)序列，采用MEGA 6.0 軟件進行多重序列比對分析，用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap 檢驗，且Bootstrap 值為1000。

1.4 α-淀粉酶活力測定［11，12］

酶活力定義:在合適溫度下，l mL 酶液1 min 內(nèi)催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物變化0.01 個吸光值定義為1個酶活力單位。

α-淀粉酶活力測定采用碘比色改良法進行，具體操作步驟如下:分別吸取5.0 mL 0.4%的可溶性淀粉溶液和一定pH 的0.2 mol/L 磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖溶液5.0 mL 于樣品和空白對照試管中，在一定溫度恒溫水浴中預(yù)熱平衡5 min。然后在樣品管中加入適度稀釋待測酶液2.0 mL，同時空白對照管中加入煮沸的酶液2.0 mL(或加同體積的緩沖液2.0 mL)，用秒表記錄時間，搖勻，準(zhǔn)確酶解反應(yīng)5 min 后立即吸取反應(yīng)液1.0 mL，加入到預(yù)先盛有0.5 mL 鹽酸(0.1 mol/L)和5.0 mL 稀碘液(需當(dāng)天配制，取原碘液2.0 mL，加碘化鉀20 g，加蒸餾水溶解定容至500 mL，貯于棕色瓶內(nèi))的試管中，搖勻，冰浴中終止反應(yīng)，于580 nm 波長下，用10 mm 比色皿迅速測定其吸光度值(OD)。以1.0 mL 水代替1.0 mL 反應(yīng)液為參比對照。

OD0為空白對照吸光度值，OD 為樣品吸光度值，2 為酶液體積(mL)，5 為反應(yīng)時間(min)。

1.5 α-淀粉酶酶液制備

將斜面菌種接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上，37 ℃活化培養(yǎng)24 h 后，挑取1 環(huán)接種到裝有50 mL 生長培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，37 ℃、200 rpm 培養(yǎng)，待OD600值達到5.0 時，按1%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 h，發(fā)酵液于12000 rpm 離心5 min，取上清液作為酶液，用于各種酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.6 α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 酶反應(yīng)最適溫度測定

按照上述酶活力測定方法，保持其他條件恒定，分別在40、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃測定酶活，以溫度為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)繪制曲線，得到酶反應(yīng)最適溫度。以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.6.2 酶反應(yīng)最適pH 測定

按照上述酶活力測定方法，保持其他條件恒定，分別在pH 3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、7.0、8.0 測定酶活，以pH 為橫坐標(biāo)，相對酶活為縱坐標(biāo)繪制曲線，得到酶反應(yīng)最適pH。以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.6.3 酶的熱穩(wěn)定性

將酶液分別在50、60、70、80、90、100 ℃的條件下，分別保溫5，10、20、30、45、60 min 后，迅速置于冰水中冷卻后，在上述確定的最適反應(yīng)溫度和pH條件下測定剩余酶活。以保溫時間為橫坐標(biāo)，相對酶活為縱坐標(biāo)，繪制曲線。以未處理的原酶液的酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.6.4 酶的pH 穩(wěn)定性

用磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液將酶液調(diào)pH 分別為4.0、4.6、5.0、6.0、7.0、8.0，放置5、10、20、30、45、60 min 后，調(diào)節(jié)pH 至最適反應(yīng)pH 值，再測酶活。

在上述確定的最適反應(yīng)溫度和pH 條件下測定剩余酶活。以保溫時間為橫坐標(biāo)，相對酶活為縱坐標(biāo)，繪制曲線。以未處理的原酶液的酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.6.5 金屬離子對酶穩(wěn)定性影響

分別配制10 mmol/L 的Na+、K+、Li+、Ba2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+、Cu2+，EDTA 共九種離子的母液。取酶液，分別加入不同離子母液，得到金屬離子終濃度2.5 mmol/L 的酶液，在室溫放置60 min 后，在上述確定的最適反應(yīng)溫度和pH 條件下測定酶活。觀察不同金屬離子作用下的剩余酶活，以不含金屬離子的原酶液的酶活力為100%，計算相對酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)特征

菌株AF1 在LB 培養(yǎng)基上生長良好，形成圓形菌落，乳白色，不透明，表面干燥粗糙，有隆起，邊緣不規(guī)則。菌體形態(tài)為桿狀、單生，革蘭氏染色呈陽性，芽孢呈橢圓形，端生(見圖1)。

圖1 AF1 的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological characteristics of AF1 cells

2.1.2 生理生化特征

生理生化試驗結(jié)果見表1。綜合供試菌株AF1的形態(tài)特征及生理生化特性，《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應(yīng)屬、種的有關(guān)性狀，可將AF1 菌歸入芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表1 菌株AF1 生理生化特征Table 1 Biochemical and physiological characteristics of strain AF1

2.1.3 16S rDNA 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

AF1 的16S rDNA 的基因全序列長度為1475 bp，在GenBank 中的登錄號為:KM373520。將獲得的基因序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行Blast 同源性比對分析，結(jié)果表明，AF1 的16S rDNA 序列與許多Bacillus amyloliquefaciens 和Bacillus subtilis 相似性均為99%。從中選取部分同源性較高的菌種，用MEGA 6.0 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)AF1 與Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 聚在一個進化分支上，如圖2。

圖2 菌株AF1 16S rDNA 全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic neighbor-joining tree based on 16S rDNA sequence of strain AF1

綜合上述AF1 菌株的形態(tài)、生理生化特征，以及16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，確定AF1 菌株為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

2.2 α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 酶反應(yīng)最適溫度

圖3 溫度對酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on α-amylase activity

在不同溫度條件下，pH 5.0 時測定α-淀粉酶活力。如圖3 顯示，此菌株的α-淀粉酶反應(yīng)的最適溫度是75 ℃，在55～80 ℃之間相對酶活較高，在40～75 ℃范圍內(nèi)酶活力隨溫度上升而升高，75 ℃時酶活力達到最高，隨后酶活力隨溫度上升而下降。

2.2.2 酶反應(yīng)最適pH

在不同pH 條件下，75 ℃時測定α-淀粉酶的活力。如圖4 所示，菌株AF1 所產(chǎn)的α-淀粉酶的活力受酸堿度影響較大，在偏酸條件下酶活力較高。其最適pH 為5.0，在pH 4.5～6.5 之間，相對酶活在80%以上。

圖4 pH 對酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on α-amylase activity

2.2.3 酶熱穩(wěn)定性研究

酶液在不同溫度保溫不同時間后測定酶液活力，結(jié)果見圖5。在1 h 內(nèi)，60 ℃以下，該酶相對比較穩(wěn)定，剩余酶活力80%以上，而70 ℃以上，酶活力下降很快，到80 ℃時，保溫僅30 min，剩余酶活力為0。

圖5 溫度對酶的穩(wěn)定性影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme stability

2.2.4 酶pH 穩(wěn)定性

將酶液用不同pH 的緩沖液處理不同時間后，測定各剩余酶活，結(jié)果如圖6 所示。該酶在pH 5.0～7.0 處理1 h 后，剩余酶活≥80%，非常穩(wěn)定。在pH≤4.6 和pH≥8.0 時，處理1 h 后，剩余酶活則不足50%。

圖6 pH 對酶的穩(wěn)定性影響Fig.6 Effect of pH on enzyme stability

圖7 金屬離子對酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of metal ions on enzyme stability

2.2.5 金屬離子對酶的穩(wěn)定性影響

取酶液，分別加入一定濃度的不同離子母液，得到金屬離子終濃度2.5 mmol/L 的酶液，在室溫放置60 min 后測定酶活，結(jié)果見圖7。Cu2+對酶活有明顯的抑制作用，酶活力降至76%;K+、Li+、Fe3+則對酶活有輕微抑制作用，只降低10%左右;而其他金屬離子Na+、Ca2+、Ba2+、Mg2+和EDTA 則對酶活沒有明顯的影響。

3 討論

當(dāng)代淀粉加工業(yè)中，α-淀粉酶在pH 6.8，Ca2+穩(wěn)定的條件下發(fā)揮活性，而天然淀粉的pH 為3.2～4.5 之間，所以為了適合α-淀粉酶的最適pH，首先得將淀粉溶液的pH 提高到5.8～6.2，而且要添加Ca2+去維持酶的穩(wěn)定性。這些步驟降低了生產(chǎn)效率和增加了成本，因此，耐酸性α-淀粉酶的研究和開發(fā)具有重要意義［8］。現(xiàn)階段，國內(nèi)外所篩選到的產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的菌株主要為芽孢桿菌和曲霉，如酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(B.acidocaldarius)A-2［13］，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(B.acidocaldarius)ATCC2709［14，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)［15］，黑曲霉(Aspergillus niger)［16］，白曲霉(Aspegillus kawachii)［17］，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus steorothermopilius)［18］等，最適pH 4.5～5.5 之間，最適溫度在30～60 ℃之間［19］，但初始酶活力均不高，且某些缺乏可靠的安全性，無法滿足實際生產(chǎn)的需要。本文中AF1 菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefacien)，是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境。AF1 菌株產(chǎn)生的α-淀粉酶最適作用溫度為75 ℃，比常見的α-淀粉酶最適溫度在30～60 ℃之間要高一些，可以降低淀粉從糊化到液化的冷卻過程中大量的冷量損耗，還可以增加液化速度。AF1 的耐酸性α-淀粉酶最適反應(yīng)pH 為5.0，與淀粉加工過程中的糖化酶偶聯(lián)作用，可避免pH的調(diào)節(jié)，從而精簡工序，節(jié)約成本。該酶在pH 5.0～7.0 范圍內(nèi)酶活比較穩(wěn)定，Cu2+對酶活有明顯的抑制作用，Na+，Ca2+，Ba2+，Mg2+和EDTA 則對酶活沒有明顯的影響。目前，工業(yè)上所用的商品化α-淀粉酶多數(shù)需要依賴Ca2+來維持穩(wěn)定性和活性，但是高果糖漿生產(chǎn)工藝中的Ca2+會抑制葡萄糖異構(gòu)酶的作用［4，5］，因此，開發(fā)不依賴Ca2+的α-淀粉酶具有更好的發(fā)展前景。目前國內(nèi)外已有部分研究者選育篩選了不依賴Ca2+的α-淀粉酶菌株［20-22］，本研究中的α-淀粉酶是一種不依賴于Ca2+的耐酸性α-淀粉酶，在淀粉加工過程中，不僅不用加Ca2+以維持酶的活性，同時可以將其與糖化酶偶聯(lián)作用，避免pH調(diào)節(jié)，能夠?qū)崿F(xiàn)在弱酸性條件下淀粉液化和糖化同步進行，從而精簡工序，節(jié)約成本。

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