呂翠翠，曹 慧，徐 斐

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，發(fā)病率約占我國(guó)人口的0.35%～0.4%，其中致殘率可達(dá)15%，然而目前對(duì)RA 尚沒(méi)有一個(gè)較好的治療方法。最近在研究人類RA 的過(guò)程中，一些學(xué)者報(bào)道了口服免疫活性肽產(chǎn)生免疫耐受可使RA 的發(fā)病過(guò)程受到抑制，其機(jī)制為T(mén) 細(xì)胞對(duì)特異性肽段的識(shí)別作用。而有效的免疫耐受的激發(fā)依賴于:抗原遞呈細(xì)胞(Antigen Processing Cells，APCs)加工處理蛋白抗原成8～10 個(gè)氨基酸組成的抗原肽，并與其表面的HLA-DR4 分子形成HLA-DR4/肽復(fù)合物，供受體特異性T 細(xì)胞表面受體(TCR)所識(shí)別，進(jìn)一步結(jié)合成TCR-HLA/DR4-抗原肽三分子復(fù)合體，T細(xì)胞被活化、增值并分泌各種免疫因子而啟動(dòng)免疫應(yīng)答［1］。

目前一些食源性免疫活性肽已經(jīng)被制備或合成，并應(yīng)用于RA 的預(yù)防和治療，但對(duì)其構(gòu)效關(guān)系仍缺乏系統(tǒng)的研究。因此，本文從AntiJen 數(shù)據(jù)庫(kù)或相關(guān)文獻(xiàn)中查閱到和RA 有關(guān)的免疫活性肽，并對(duì)其與HLA-DR4 分子的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了深入探討。

1 與RA 相關(guān)的免疫活性肽

免疫活性肽是一類具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化成熟、轉(zhuǎn)移免疫信息機(jī)及增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能等生物學(xué)功能的肽［2］。到目前為止，科研工作者已從乳蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、魚(yú)貝類蛋白、膠原蛋白等蛋白酶解物中分離出多種具有免疫活性的肽段。然而，與RA 相關(guān)的免疫活性肽的開(kāi)發(fā)卻十分有限，不同來(lái)源的氨基酸組成及結(jié)構(gòu)的免疫活性肽的IC50值差異也較大(見(jiàn)表1)。

表1 與RA 有關(guān)的免疫活性肽及活性值Table 1 Immunoactive peptides and the IC50values related to RA

2 HLA-DR4 分子的結(jié)構(gòu)特征

HLA-DR4 分子由MHC II 基因群編碼，由于其最先在白細(xì)胞表面被發(fā)現(xiàn)且含量較高，所以稱為人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)。有足夠的證據(jù)發(fā)現(xiàn)和RA 有關(guān)的人類白細(xì)胞抗原主要為HLA-0401、0404、0405 等亞型，其中絕大部分為HLA-DR4* 0401［3，4］。Lanchbury［5-7］等通過(guò)研究不同地區(qū)RA 患病情況的結(jié)果表明HLA-DR4* 0401相對(duì)于其他等位基因，其致病的可能性更高，尤其是對(duì)嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎患者，其92%～95% 的發(fā)病是由HLA-DR4* 0401 分子引起的。由于HLA-DR4 分子在人類免疫疾病中起重要作用，其結(jié)構(gòu)已被廣泛研究。發(fā)現(xiàn)其分子晶體結(jié)構(gòu)是由α 鏈和β 鏈以非共價(jià)鍵連接的異源二聚體，α 鏈由α1 和α2 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，β 鏈由β1 和β2 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，α1 和β1 結(jié)構(gòu)域各含有1 個(gè)α 螺旋和4 個(gè)β 片層，它們形成了抗原肽結(jié)合槽(peptide-binding groove)，其中，α 螺旋為結(jié)合槽壁，β 片層為結(jié)合槽底［8］(見(jiàn)圖1)。該抗原結(jié)合槽的兩端是開(kāi)口的，所以抗原肽在結(jié)合槽內(nèi)可以向兩端伸展。抗原肽主要借助特定錨定殘基(anchor residue)駐扎在HLA-DR4 分子槽底部深淺不同的“口袋”(Pocket)中，其中，最重要的6 個(gè)口袋分別是Pocket 1、2、4、6、7、9(命名為P1、P2、P4、P6、P7、P9)(見(jiàn)圖2、圖3)［9］。這些Pockets 富含多態(tài)性氨基酸，且某一等位基因編碼的HLA-DR4 分子只能識(shí)別具有某一特定結(jié)構(gòu)的一組抗原肽［10，11］。根據(jù)HLA-DR4 分子結(jié)構(gòu)及CD4+T 細(xì)胞識(shí)別抗原肽序列的研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DR4 分子的抗原結(jié)合槽一般可以容納長(zhǎng)度為13 個(gè)氨基酸殘基的抗原肽，但能被CD4+T 細(xì)胞識(shí)別的抗原肽僅有9 個(gè)氨基酸殘基，這9 個(gè)氨基酸序列稱為核心結(jié)合序列(core binding sequence)，它在抗原肽與MHC II 類分子的特異性結(jié)合中起關(guān)鍵作用［12-14］。

圖1 HLA-DR4 的分子結(jié)構(gòu)圖［10］Fig.1 Structural and molecular characteristics of HLA-DR4

圖2 HLA-DR4 分子的6 個(gè)主要抗原結(jié)合口袋［11］Fig.2 The peptide-binding groove of HLA-DR4

圖3 HLA-DR4 分子的抗原肽結(jié)合口袋［9］Fig.3 Antigenic peptide binding pocket of HLA-DR4

3 抗RA 免疫活性肽與HLA-DR 分子的作用機(jī)理

目前，已有學(xué)者對(duì)抗RA 免疫活性肽與其功能之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)抗RA 免疫活性肽氨基酸殘基的帶電性質(zhì)、大小及疏水性等性質(zhì)直接影響其與HLA-DR4 分子的結(jié)合［15-17］。因而，對(duì)抗RA免疫活性肽的性質(zhì)與HLA-DR4 X 射線衍射晶體結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行深入探討，有助于更好的解釋其構(gòu)效關(guān)系。

根據(jù)與RA 相關(guān)的免疫活性肽的氨基酸組成可見(jiàn)(表1)，其P-2 位置的氨基酸絕大部分為丙氨酸。Fugger［18］等研究證實(shí)P-2 位置的丙氨酸丟失可導(dǎo)致抗原肽與HLA-DR4 分子的結(jié)合能力損失6-7 倍，但對(duì)T 細(xì)胞的活化沒(méi)有影響。Dessen［9］等通過(guò)X 晶體射線研究表明該位置側(cè)鏈上的氫鍵對(duì)于TCR 與HLA-DR4 分子的結(jié)合起重要作用，這可能是由于側(cè)鏈形成的氫鍵容易從肽-HLA-DR4 結(jié)合物中突出延伸出來(lái)，從而有利于其結(jié)合。由此可見(jiàn)，P-2 位置上的丙氨酸可能主要起到結(jié)合HLA-DR4 分子的作用。P-1 和P3 位置的氨基酸絕大部分為甘氨酸。Fugger［18］等研究發(fā)現(xiàn)P-1 位置甘氨酸丟失可導(dǎo)致抗原肽與HLA-DR4 分子的結(jié)合能力損失40 倍，并會(huì)影響T 細(xì)胞的活化。P3 位置甘氨酸的作用與之類似，即側(cè)鏈形成的氫鍵從肽-HLA 結(jié)合物中突出延伸出來(lái)，使TCR 與HLA 分子結(jié)合的更緊密。Rosloniec［19］和Andersson［20］等研究還發(fā)現(xiàn)，在P3 位置用丙氨酸替代甘氨酸，可使抗原肽與HLA-DR4 分子的結(jié)合能力顯著增強(qiáng)。由此說(shuō)明，此位置氨基酸殘基的立體特性與抗原肽的免疫活性密切相關(guān)，因而推測(cè)分子較小的甘氨酸殘基更適合此位置。

置于Pocket 1 中的P 1 位置的氨基酸絕大部分為苯丙氨酸，其次為亮氨酸和纈氨酸。這三種氨基酸都是疏水性氨基酸，具有疏水性側(cè)鏈。Andersson［20］等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)P1 的苯丙氨酸被帶有芳香族側(cè)鏈的氨基酸，如酪氨酸取代對(duì)T 細(xì)胞的活化僅有微弱的影響。但P1 的苯丙氨酸(F)丟失對(duì)T 細(xì)胞的活化有顯著影響［18］。因?yàn)楸奖彼岬氖杷詡?cè)鏈易與Pocket 1 內(nèi)壁上的氨基酸(多為β 鏈上的Gly86)相互作用形成疏水內(nèi)核，提高了抗原肽與HLA-DR4 分子的親和力及形成復(fù)合物的穩(wěn)定性，從而有利于抗原肽被MHC 分子遞呈到抗原遞呈細(xì)胞的表面［21］。HLA-DR4 分子的Pocket 1 為較深的疏水性口袋，主要由α 鏈上的殘基Ile7、Ile31、Phe32、Phe34、Trp43 及β 鏈上的殘基Val85、Gly86、Phe89 和Thr90 組成［12］。由此可見(jiàn)，P-1 位置氨基酸殘基的親水特征與抗原肽的免疫活性密切相關(guān)。

Hammer［22，23］等 研 究 發(fā) 現(xiàn)HLA-DR4 分 子 的Pocket 2 只接受帶負(fù)電的氨基酸，但從搜集的抗RA免疫活性肽的組成來(lái)看，出現(xiàn)在Pocket 2 中的多為帶正電的賴氨酸和精氨酸，這可能是由于HLA-DR4分子與抗原肽的結(jié)合不僅取決于氨基酸的帶電性質(zhì)，還與其分子大小密切相關(guān)。Dessen［9］通過(guò)X-射線衍射獲得了HLA-DR4 的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)HLADR4 分子中的Pocket 2 比較深，只有長(zhǎng)側(cè)鏈的氨基酸殘基才會(huì)被緊密的綁定到其結(jié)合槽中(見(jiàn)圖3)，從而有利于T 細(xì)胞受體識(shí)別。而賴氨酸和精氨酸的側(cè)鏈都比較長(zhǎng)，符合Pocket 2 的特點(diǎn)。此外，精氨酸的側(cè)鏈可突出結(jié)合槽，使其更容易被T 細(xì)胞受體識(shí)別，而且精氨酸的胍基團(tuán)所帶正電荷可以與HLADR4 分子Pocket 2 中Thr-β77 的氧原子形成氫鍵，從而增強(qiáng)其結(jié)合力。Edward［24］等研究也發(fā)現(xiàn)，P1的苯丙氨酸和P2 的賴氨酸對(duì)抗原肽與HLA 分子的結(jié)合至關(guān)重要，如果取代了這兩個(gè)位置的氨基酸，其結(jié)合力顯著下降。

Pocket 4 是由β 鏈第70 位至74 位一段高度保守的五氨基酸序列，即QKRAA 構(gòu)成的一個(gè)肽錨定區(qū)域［25，26］。由于Pocket 4 底部β71 位置上的賴氨酸(K)或精氨酸(R)帶正電荷，因而推測(cè)其對(duì)抗原肽中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基有較高的親和力，而帶正電荷的氨基酸殘基則抑制其結(jié)合。這與表1 中P4位置絕大部分為谷氨酸，其次是天冬氨酸是一致的。Fugger［18］的研究表明帶負(fù)電的谷氨酸的側(cè)鏈伸向槽內(nèi)，和帶正電的Pocket 4 的肽結(jié)合槽的結(jié)合能力非常強(qiáng)，從而有利于T 細(xì)胞識(shí)別。同時(shí)，Dessen［9］等研究也發(fā)現(xiàn)，Pocket 4 適合側(cè)鏈比較大的氨基酸。20 種天然氨基酸中符合既帶負(fù)電又有較長(zhǎng)側(cè)鏈的的氨基酸只有谷氨酸和天冬氨酸兩種，而谷氨酸的側(cè)鏈比天冬氨酸的長(zhǎng)，所以P4 的谷氨酸對(duì)于抗原肽與MHC 分子的結(jié)合性起非常重要的作用。

Li 等［27-29］通過(guò)單個(gè)氨基酸替換代實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬等方法證實(shí)P5 和P8 的氨基酸對(duì)HLA 分子與T 細(xì)胞受體的接觸起重要作用。由表1 可見(jiàn)，這兩個(gè)位置絕大多數(shù)的氨基酸分別是谷氨酰胺和賴氨酸，側(cè)鏈都較長(zhǎng)，而HLA-DR4 分子P5 和P8 處的口袋都不深(見(jiàn)圖3)，由此推測(cè)該位置氨基酸長(zhǎng)側(cè)鏈會(huì)突出肽-HLA-DR4 結(jié)合槽，從而有利于與TCR 相作用。Jardetzky［30］等通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)分析研究也發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞的活化需要抗原肽與HLA-DR4 分子在抗原呈遞細(xì)胞表面相接觸，有較長(zhǎng)側(cè)鏈的氨基酸的一部分側(cè)鏈和TCR 相結(jié)合，而另一部分則包埋在HLADR4 分子的抗原結(jié)合槽口袋里。Fugger［18］等研究表明刪除了該位置的賴氨酸，對(duì)T 細(xì)胞的刺激性顯著降低。由此推測(cè)，P5 和P8 對(duì)HLA 分子與T 細(xì)胞受體的接觸也起重要作用。

Dessen［9］和Hammer［22］等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在HLA-DR4分子的α鏈上有兩個(gè)保守氨基酸，分別為Glu11 和Asp66，這兩個(gè)氨基酸在空間上彼此靠近并形成氫鍵，從而阻止Pocket 6 與帶電荷的氨基酸或長(zhǎng)鏈氨基酸發(fā)生相互作用，因此Pocket 6 易于容納小體積、不帶電的或非長(zhǎng)鏈的氨基酸殘基。此外，由圖3 也可看出，組成Pocket 6 的氨基酸形成了一個(gè)較淺的小口袋，這進(jìn)一步說(shuō)明此位置只適合側(cè)鏈較短的氨基酸。

結(jié)合于Pocket 7 中的氨基酸絕大部分為脯氨酸(見(jiàn)表1)Fugger［18］等研究表明如果剔除P7 的脯氨酸，HLA-DR4 分子與抗原肽的結(jié)合力及對(duì)T 細(xì)胞的刺激作用都明顯降低。Andersson［20］等研究也發(fā)現(xiàn)如果用丙氨酸替換P7 的脯氨酸會(huì)導(dǎo)致抗原肽與HLA-DR4 分子的結(jié)合能力降低5-10 倍。這可能是由于Pocket 7 比較淺但底部較寬(見(jiàn)圖3)，所以比較適合側(cè)鏈短且大的氨基酸，而脯氨酸正好符合此特點(diǎn)，這與Dessen［9］等研究的脯氨酸適合淺口袋的Pocket 7 是一致的。

由圖3 可看出，Pocket 9 非常淺，所以該位置只適合側(cè)鏈比較小的氨基酸。Dessen［9］等研究也表明分子很小的甘氨酸適合Pocket 9。Andersson［20］等的研究表明用帶極性的氨基酸替換P9 的甘氨酸后抗原肽與HLA-DR4 分子的結(jié)合能力增強(qiáng)5～10 倍，這有可能是因?yàn)镻ocket 9 中HLA-DR4 分子的β57天冬氨酸可以和α76 精氨酸形成鹽橋，從而易于結(jié)合帶極性側(cè)鏈的氨基酸，比如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸等。

抗原結(jié)合槽一般容納13 個(gè)氨基酸的抗原肽，但能被T 細(xì)胞識(shí)別的抗原肽僅有9 個(gè)氨基酸，所以P10 和P11 的氨基酸對(duì)整個(gè)分子的結(jié)合力做出的貢獻(xiàn)非常小，由圖3 可見(jiàn)，這兩個(gè)位置的口袋非常淺，而與之結(jié)合的氨基酸側(cè)鏈又比較長(zhǎng)，所以側(cè)鏈與結(jié)合槽的作用不一定緊密，該位置所提供的分子結(jié)合力很有限。Andersson［20］等的研究表明用丙氨酸替換P10 的谷氨酸后抗原肽與HLA-DR4 分子的結(jié)合能力增加，這證明了以上假說(shuō)是成立的。

4 結(jié)論

本研究對(duì)抗類風(fēng)濕性免疫活性肽與HLA-DR4分子的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行了深入探討?？诡愶L(fēng)濕性免疫活性肽起主要免疫活性作用的9 個(gè)氨基酸核心結(jié)合序列為P1-P9，核心結(jié)合序列兩端的氨基酸對(duì)肽的結(jié)合性的影響很小。作為主要錨點(diǎn)的P1 位疏水性氨基酸和次要錨點(diǎn)的P6 位極性小分子可包埋在HLA-DR4 分子的結(jié)合槽中，因而對(duì)免疫活性肽與HLA-DR4 分子的結(jié)合尤為重要。而P2 位的帶正電荷氨基酸，P3 位的極性小分子，P4 位帶負(fù)，長(zhǎng)側(cè)鏈的氨基酸以及P5 位帶長(zhǎng)側(cè)鏈氨基酸主要負(fù)責(zé)其與HLA-DR4 分子的綁定，在這幾個(gè)位置的氨基酸側(cè)鏈會(huì)突出肽-HLA 分子結(jié)合槽，從而有利于TCR 的識(shí)別。P7、P8 和P9 位的口袋較淺，因而其與抗原肽氨基酸殘基的結(jié)合力相對(duì)較弱。

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