杜鋼軍,許嚴(yán)偉,林海紅

(1.河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開封475004;2.洛陽(yáng)市第三人民醫(yī)院藥劑科,河南洛陽(yáng)471002)

棘霉素對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)及相關(guān)激酶的影響

杜鋼軍1,許嚴(yán)偉2,林海紅1

(1.河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開封475004;2.洛陽(yáng)市第三人民醫(yī)院藥劑科,河南洛陽(yáng)471002)

目的研究棘霉素對(duì)人白血病細(xì)胞K562生長(zhǎng)及相關(guān)激酶的影響。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞,采用0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0μg/L棘霉素分別處理24 h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期分布, Western blot檢測(cè)Bcr-Abl、AKT的表達(dá)。結(jié)果棘霉素對(duì)K562細(xì)胞的IC50為0.82μg/L。隨著濃度的增加,棘霉素對(duì)酪氨酸激酶的抑制作用增強(qiáng);棘霉素在2.0μg/L時(shí),其抑制細(xì)胞蛋白激酶B的磷酸化程度最高。結(jié)論棘霉素可以抑制K562細(xì)胞的增殖,其機(jī)制與抑制酪氨酸激酶和下調(diào)蛋白激酶B的作用有關(guān)。

棘霉素;K562;細(xì)胞周期;Bcr-abl;AKT

棘霉素是從放線菌代謝物中分離得到的一種具有細(xì)胞毒作用的抗生素,它通過(guò)與DNA結(jié)合后可以抑制RNA的合成[1]。研究表明,棘霉素對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用,例如肺癌,黑色素瘤,前列腺癌,中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,結(jié)腸癌,乳腺癌,卵巢癌等[2]。棘霉素對(duì)白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)也有報(bào)道[3],但棘霉素對(duì)白血病K562細(xì)胞的研究還未見報(bào)道。我們實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)我國(guó)邊遠(yuǎn)地區(qū)土壤微生物的篩選,發(fā)現(xiàn)一株土壤放線菌提取物,經(jīng)過(guò)活性追蹤分離純化并鑒定其中的活性成分是蒽醌類抗生素-棘霉素(echinomycin)。

慢性髓細(xì)胞性白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是血液系統(tǒng)最常見的惡性疾病之一,在國(guó)內(nèi)年發(fā)病率約為0.36/10萬(wàn),占白血病的第三位[4]。K562細(xì)胞系來(lái)源于急變期CML患者,是研究CML經(jīng)典的細(xì)胞模型,我們選擇K562細(xì)胞作為研究對(duì)象,對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離純化的棘霉素[5]的體外抗腫瘤作用及其機(jī)制進(jìn)行了研究,為其用于治療CML的可行性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株:K562細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所惠贈(zèng)。K562細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素各100 U/m L的RPMI 1640培養(yǎng)基中,37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中,實(shí)驗(yàn)時(shí)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

試劑與藥品:棘霉素來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室的分離純化,測(cè)得純度為94.6%,Bcr-Abl(山羊多克隆一抗和FITC標(biāo)記的兔抗山羊二抗)、AKT(小鼠一抗和山羊抗小鼠二抗)均為Sant Cruz公司產(chǎn)品;MTT、DMSO購(gòu)自Sigma公司;其他試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

儀器:Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司);FACScalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 MTT檢測(cè)

采用MTT法[6]。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/m L,接種于96孔板,180μL/孔,置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2,37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h;實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的棘霉素各20μL,使其終濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0μg/L,另外,設(shè)加入不同濃度的伊馬替尼,其終濃度分別為0.03、0.01、0.1、0.3、1.0、3.0 mg/L。各對(duì)照組加入20μL培養(yǎng)基,每組4個(gè)復(fù)孔。再培養(yǎng)48 h后,平板離心后除去上面培養(yǎng)基每孔加含MTT質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5 g/L的PBS(p H 6.8)溶液100μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心并棄去上清,每孔加DMSO 100μL,避光振蕩5 min,充分溶解后,于酶標(biāo)儀570 nm處檢測(cè)吸光度值(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(正常對(duì)照組OD值―用藥組OD值)/正常對(duì)照組OD值×100%。

1.3 細(xì)胞周期檢測(cè)

培養(yǎng)細(xì)胞、分組。實(shí)驗(yàn)組棘霉素最終濃度為2.0μg/L,處理24 h,并設(shè)空白對(duì)照,收集各組細(xì)胞于離心管中,離心(1000 r/min,5 min)后用冰冷的PBS洗細(xì)胞2次棄去上清液;將細(xì)胞(大于1×106)沉淀重懸于含體積分?jǐn)?shù)70%乙醇的PBS 500μL中,固定細(xì)胞30 min以上。離心后,棄上清。2 m L的PBS懸浮,離心后,棄上清。留下約50μL細(xì)胞懸液加10μL的RNase(10 g/L)。37℃水浴30 min后加PBS約300μL后加入碘化丙啶(PI)(終濃度20 mg/L)染色,室溫下避光15 min,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 Western Blot法檢測(cè)Bcl-Abl、磷酸化和非磷酸化的AKT

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞,設(shè)高、中、低3組,檢測(cè)Bcr-Abl設(shè)棘霉素濃度為1.0、2.0、4.0μg/L,檢測(cè)AKT設(shè)棘霉素終濃度分別為0.5、1.0、2.0μg/L,并設(shè)空白對(duì)照組。藥物作用細(xì)胞12 h后,收集細(xì)胞于離心管中。細(xì)胞裂解細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS洗2遍,轉(zhuǎn)入1.5 m L EP管中,離心后加入100μL細(xì)胞裂解液放置4℃裂解40 min。4℃,10 000 g,30 min離心濃縮,將上清液轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中備用。將棘霉素作用過(guò)的K562細(xì)胞中提取的10μg蛋白樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,進(jìn)行免疫印跡分析。過(guò)程如下:用脫脂牛奶對(duì)膜進(jìn)行封閉,加入1∶1 000稀釋的抗Bcr-Abl、AKT及磷酸化抗體,常溫孵育2 h,用體積分?jǐn)?shù)0.1%Tween20的TBS洗膜3次,加入1∶3 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊二抗,常溫孵育45 min,用體積分?jǐn)?shù)為0.1%Tween 20的TBS洗膜3次,加入發(fā)光劑,曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 棘霉素對(duì)K562細(xì)胞增值的影響

伊馬替尼IC50為0.19 mg/L,棘霉素IC50為0.82μg/L,見圖1。

圖1 棘霉素對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響

2.2 棘霉素對(duì)K562細(xì)胞周期的影響

結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞G1期和G2期比例顯著下降,S期比例明顯升高,見表1。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)比較,見圖2。

表1 棘霉素對(duì)K562細(xì)胞周期的影響 (%)

圖2 棘霉素對(duì)K562細(xì)胞周期的影響(A:對(duì)照組;B:實(shí)驗(yàn)組)

2.3 不同濃度棘霉素對(duì)Bcr-Abl蛋白的影響

在K562細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,不同濃度的棘霉素對(duì)Bcr-Abl的表達(dá)均有不同程度的抑制作用,見圖3。

圖3 不同濃度棘霉素處理K562細(xì)胞后Bcr-Abl的表達(dá)

2.4 不同濃度棘霉素對(duì)磷酸化和非磷酸化AKT蛋白的影響

以0μg/L的棘霉素作為對(duì)照組,對(duì)于K562細(xì)胞,2.0μg/L的棘霉素其抑制細(xì)胞AKT的磷酸化程度最高。

圖4 棘霉素對(duì)K562細(xì)胞中AKT表達(dá)的影響

3 討論

棘霉素對(duì)K562細(xì)胞作用的系統(tǒng)性研究未見報(bào)道,我們選用人白血病K562細(xì)胞作為研究對(duì)象,以伊馬替尼作為對(duì)照,棘霉素對(duì)K562細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,IC50為0.82μg/L,且其作用呈劑量依賴性(見圖1)。該研究通過(guò)觀察棘霉素對(duì)K562細(xì)胞周期的影響,發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組G1期及G2期細(xì)胞比例明顯下降;S期比例明顯升高,從51.24%升高到65.90%。說(shuō)明棘霉素主要是通過(guò)抑制細(xì)胞合成期導(dǎo)致K562細(xì)胞的凋亡。Western-blot結(jié)果顯示,不同棘霉素作用24 h后Bcr-Abl的表達(dá)明顯受到抑制,說(shuō)明棘霉素對(duì)Bcr-Abl有一定程度的抑制作用。同樣方法檢測(cè)細(xì)胞中AKT信號(hào)通路的表達(dá),結(jié)果顯示不同劑量的棘霉素對(duì)AKT信號(hào)通路均有不同程度的調(diào)節(jié)作用。與AKT相比,P-AKT的表達(dá)明顯降低(見圖4)。

CML是一種起源于造血干細(xì)胞的獲得性克隆性疾病,其分子生物學(xué)特征是存在Bcr-Abl融合基因,該基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生分子量為210 KDa的融合蛋白P210 Bcr/Abl,該融合蛋白具有異常增高的酪氨酸激酶活性,使造血干細(xì)胞發(fā)生異常轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致CML的發(fā)生。治療CML的靶向藥物是酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼。但是,近年來(lái)大部分患者對(duì)伊馬替尼的應(yīng)答期較短,最終可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)其耐藥[7]。這種耐藥性的獲得是由于Bcr-Abl的復(fù)活產(chǎn)生的,而Bcr-Abl的復(fù)活主要是由于酪氨酸激酶的變異和基因的擴(kuò)增引起的。我們實(shí)驗(yàn)室致力于尋找一種既能抑制Bcr-Abl,又能克服伊馬替尼耐藥的其他藥物。在前期的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)棘霉素能強(qiáng)烈抑制K562細(xì)胞的增殖。如果能發(fā)現(xiàn)棘霉素是通過(guò)抑制Bcr-Abl的作用而致使K562細(xì)胞死亡,那么就對(duì)伊馬替尼的耐藥問(wèn)題提供新的解決途徑。

PI-3K/Akt(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路)作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一,通過(guò)影響下游凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白等效應(yīng)分子的活性,在抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)增殖中發(fā)揮著極為重要的作用。它具有以下作用:促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,抑制細(xì)胞凋亡;促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移;促進(jìn)血管生成,抵抗化療和放療中的細(xì)胞凋亡。PI-3K/Akt作為生長(zhǎng)因子受體超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中重要成員,可受多種細(xì)胞因子和理化因素激活,是聯(lián)系細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的關(guān)鍵分子[8]。研究棘霉素對(duì)K562細(xì)胞中AKT的影響對(duì)于進(jìn)一步證實(shí)棘霉素的作用機(jī)制有重要意義。

綜上所述,棘霉素能顯著抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng),其機(jī)制可能與其抑制Bcr-Abl的表達(dá)和影響AKT信號(hào)通路有關(guān)。試驗(yàn)為治療CML患者提供新的治療方向。該實(shí)驗(yàn)僅為研究棘霉素作用的一部分,進(jìn)一步的體外、體內(nèi)試驗(yàn)還在進(jìn)一步研究中。

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[責(zé)任編輯 時(shí) 紅]

Effect of Echinomycin on Growth of K562 Cell Line and Related Kinases

DU Gangjun1，XU Yanwei2，LIN Haihong1
（1.Phɑrmɑceutiɑl College，Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ；2.Depɑrtment of Phɑrmɑcy，Luoyɑng Third People's Hospitɑl，Luoyɑng，Henɑn 471002，Chinɑ）

ObjectiveTo explore the effect of echinomycin on the growth of K562 cell.MethodsIn experiments，K562 cells were treated with different concentrations（0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，3.0μg/L），and the cell proliferation was determined by MTT assay.The cell cycle，Bcl-Abl and AKT were examined by FACS，Western blot methods，respectively.ResultsThe survival rate of K562 cells decreased gradually as the increase of echinomycin concentration，and the IC50was 0.82μg/L.With the increase of concentration，echinomycin dose-dependently inhibited the expression of tyrosine kinase，；the highest inhibition of AKT phosphorylation by echinomycin was seen at the concentration of 2.0μg/L.Conclusionechinomycin can inhibit the proliferation of K562 cells，and the underlying mechanism may be related to inhibition of Bcr-Abl and reduction of protein kinase B.phosphorylated AKT.

echinomycin；K562；cell cycle；Bcr-Abl；AKT

R966

A

1672―7606(2015)04―0229―03

2015-10-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30472082)

杜鋼軍(1971―),男,河南開封人,博士,教授,從事腫瘤藥理學(xué)的研究工作。