許嚴偉,林海紅,杜鋼軍*

(1.洛陽市第三人民醫(yī)院藥劑科,河南洛陽471002;2.河南大學藥學院,河南開封475004)

棘霉素對伊馬替尼敏感及耐藥K562細胞ERK、AKT和SPK表達的影響

許嚴偉1,林海紅2,杜鋼軍2*

(1.洛陽市第三人民醫(yī)院藥劑科,河南洛陽471002;2.河南大學藥學院,河南開封475004)

目的比較棘霉素對伊馬替尼敏感及耐藥K562細胞ERK、AKT和SPK表達的影響。方法MTT法檢測細胞存活率,Western blot檢測ERK和AKT的表達,同位素摻入檢測SPK的活性。結(jié)果棘霉素對K562和耐伊馬替尼細胞的IC50分別為0.82 mg/L和0.87 mg/L;棘霉素對ERK和AKT均有不同程度的抑制作用;耐藥K562細胞中SPK的表達遠高于敏感細胞,且棘霉素對耐藥細胞中的SPK活性有顯著抑制作用。結(jié)論棘霉素對敏感及耐藥K562細胞均有較強的抑制作用,其機制與抑制ERK、AKT和SPK的作用有關。

棘霉素;K562;耐藥;ERK;AKT;SPK

甲磺酸―伊馬替尼(格列衛(wèi))是基于對癌細胞分子作用機理的了解而合理設計開發(fā)的第一個抗癌新藥,被譽為里程碑式的發(fā)現(xiàn)。作為首個上市的分子靶向治療藥物,開創(chuàng)了腫瘤分子靶向治療的新時代。伊馬替尼在挽救了無數(shù)慢性粒細胞白血病(CML)患者的同時,也贏得了無數(shù)的榮譽[1]。伊馬替尼自1999年開始進入臨床試驗,對干擾素無效的慢性期CML患者,血液學完全緩解率可達100%,細胞遺傳學緩解率為53%,13%患者獲得完全細胞遺傳學緩解。然而,現(xiàn)在臨床發(fā)現(xiàn),應用伊馬替尼雖然能夠使急變期的CML完全緩解,但大部分患者對伊馬替尼的應答期較短,腫瘤細胞最終對其耐藥而使CML復發(fā)[]。

因此,開發(fā)與伊馬替尼作用機理不同,能克服腫瘤細胞對伊馬替尼耐藥性的新型藥物成為當前CML治療的迫切需要。我們實驗室通過對我國邊遠地區(qū)土壤微生物的篩選,發(fā)現(xiàn)一株土壤放線菌提取物,經(jīng)過活性追蹤分離純化并鑒定其中的活性成分是蒽醌類抗生素―棘霉素(echinomycin)。K562細胞系來源于急變期CML患者,是研究CML經(jīng)典的細胞模型。我們選擇正常K562細胞及對伊馬替尼耐藥的K562細胞(K562/Ima)為靶細胞,初步觀察了棘霉素這兩種細胞中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、蛋白激酶B通路(AKT)和鞘氨醇激酶(SPK)的表達,為臨床克服伊馬替尼耐藥,尋找新的藥物提供佐證。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株:K562細胞由軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所惠贈;K562耐伊馬替尼細胞K562/Ima由中國醫(yī)學科學院天津血液研究所惠贈。K562和K562/ Ima細胞均于含體積分數(shù)10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素各10×105U/L的RPMI 1640,37℃、體積分數(shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),實驗時選用對數(shù)生長期的細胞。

試劑與藥品:磷酸化和非磷酸化ERK1/2和AKT的抗體為Sant Cruz公司產(chǎn)品;(γ-32P)ATP購自北京福瑞生物工程公司;鞘氨醇、MTT、ATP購自Sigma公司;其他試劑皆為國產(chǎn)分析純試劑。

儀器:BIO-RAD垂直電泳儀,選自美國Bio-Rad公司。

1.2 MTT檢測

選擇對數(shù)生長期的細胞,用含體積分數(shù)10%胎牛血清培養(yǎng)基將細胞配成細胞濃度為(4～5)× 105個/m L的細胞懸液,接種于96孔細胞培養(yǎng)板中180μL/孔,于體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后。實驗組加入不同濃度的棘霉素各20μL,使其終濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0μg/L。另外,設對照組加入不同濃度的伊馬替尼, K562組其終濃度分別0.03、0.01、0.1、0.3、1.0、3.0 mg/L。K562/Ima組分別為0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、20.0 mg/L。各對照組加入20μL培養(yǎng)基,另設空白組,每組4個復孔。再培養(yǎng)48 h后,平板離心后除去上面培養(yǎng)基每孔加MTT質(zhì)量分數(shù)0.5 g/L的PBS(p H6.8)溶液100μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;每孔加DMSO 100μL,避光振蕩5 min,充分溶解后,于酶標儀570 nm處檢測吸光度值(OD值)。以加藥孔OD值與對照孔OD值的百分比為細胞存活率,根據(jù)細胞存活率和藥物濃度的對應關系用SPSS軟件求藥物的IC50。

細胞的耐藥倍數(shù)計算方法:

耐藥倍數(shù)(RF)=耐藥細胞(IC50)/敏感細胞(IC50)

1.3 ERK、AKT蛋白檢測

K562和K562/Ima 2種細胞,設空白對照組和高、中、低劑量組共8組。高、中、低的棘霉素終濃度分別為1.0、2.0、4.0μg/L。作用細胞12 h后,收集細胞于離心管中。細胞裂解(注:冰上操作)細胞經(jīng)預冷的PBS洗2遍,轉(zhuǎn)入1.5 m L EP管中,離心后加入100μL細胞裂解液放置,4℃裂解40 min。4℃, 10 000 g,30 min離心濃縮,將上清液轉(zhuǎn)移至另一微量離心管中,保存于―70℃待用。用BCA法測定蛋白含量,取蛋白樣品等量,每個樣品中加入上樣緩沖液。將從K562和K562/Ima細胞中提取的10μg蛋白樣品用質(zhì)量分數(shù)10%聚丙烯酰胺凝膠進行分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,進行免疫印跡分析。過程如下:用脫脂牛奶對膜進行封閉,加入1∶1 000稀釋的一抗,常溫孵育2 h,用含體積分數(shù)0.1%Tween 20的TBS洗膜3次,加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗,常溫孵育45 min,用含體積分數(shù)0.1% Tween 20的TBS洗膜3次,加入發(fā)光劑,曝光顯影。

1.4 SPK的活性檢測

參照文獻[3]進行,分別收集處于對數(shù)生長期、細胞濃度約為5×106U/m L的K562、K562/Ima細胞,離心,加入細胞裂解緩沖液,凍融裂解3次;4℃, 14 000 g離心20 min,收集上清液。蛋白定量后取45μL樣品和Sphingosine(溶解于質(zhì)量分數(shù)為5% Triton X-100)中混勻;在同位素室內(nèi)加入2.5μL/管(32P)ATP(10μCi,20 mmol/L)含MgCl2(200 mmol/L),37℃反應5～15 min;加入1 mol/LHCl 5μL和氯仿0.2 m L氯仿∶甲醇∶鹽酸(體積比100∶200∶1)劇烈振蕩,終止反應;再加入氯仿60μL和2mol/L氯化鉀60μL,12 000 g離心5 min;棄去水相,取15μL有機相樣品點樣于硅膠上,于層析液中展開40 min;放射自顯影;掃描結(jié)果,用圖像分析軟件Scionimɑge分析光密度。

2 結(jié)果

2.1 對ERK1/2表達的影響

K562/Ima相對于K562的RF為24。棘霉素對K562細胞及K562/Ima細胞的IC50分別為0.82μg/L和0.87μg/L。對ERK1/2的表達,見圖1。

圖1 棘霉素影響K562、K562/Ima細胞中ERK1/2的表達

2.2 對AKT表達的影響(見圖2)

圖2 棘霉素影響K562、K562/Ima細胞中AKT的表達

2.3 細胞中SPK的活性(見圖3)

γ-32P法檢測K562/Ima和K562細胞中SPK活性結(jié)果,見圖3。

圖3 SPK活性的TLC結(jié)果

3 討論

Boulton等[4]分離鑒定了一種蛋白激酶的cDNA序列,并證實多種細胞外信號均可激活該蛋白激酶。因此,將其命名為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1(ERK1),分子量為44KD。1991年,Boulton等[5]又鑒定了大鼠ERK亞家族的一個主要成員ERK2,分子量為42KD。ERK主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等激活而磷酸化(p-ERK),進入細胞核作用于Elk21、c-myc、AP21等轉(zhuǎn)錄因子,促進某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達[6]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是信號從細胞表面?zhèn)鬟f到細胞核內(nèi)部的重要介質(zhì),也是聯(lián)系細胞膜受體與細胞內(nèi)重要調(diào)節(jié)靶目標的進化保守的酶類。Steinmetz等[7]提出,MAPK磷酸酶(MKP-1)的表達提高與ERK1/2的滅活有關。通過對腫瘤細胞系的蛋白酶抑制劑的治療增加了MKP-1合成,減少ERK1/2的磷酸化,從而抑制了腫瘤細胞的增殖。

PI-3K/Akt(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路)作為細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導途徑之一,通過影響下游凋亡相關蛋白、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白等效應分子的活性,在抑制細胞凋亡和促進增殖中發(fā)揮著極為重要的作用。它具有以下作用:①促進細胞的生長和增殖;②抑制細胞凋亡;③促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移;④促進血管生成;⑤抵抗化療和放療中的細胞凋亡。AKT作為生長因子受體超家族信號轉(zhuǎn)導過程中重要成員,可受多種細胞因子和理化因素激活,是聯(lián)系細胞內(nèi)外信號的關鍵分子[8]。

SPK-S1P信號通路是近年來被許多研究者所重視的一條有關細胞存亡、增殖的信號途徑。SPK是一種高度保守的脂類激酶,可激活鞘氨醇(Sp)而生成磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)。細胞內(nèi)S1P的水平受SPK活性的調(diào)節(jié)。S1P是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種同時具有細胞內(nèi)和細胞外雙重功能的膜磷脂代謝產(chǎn)物。在細胞內(nèi),S1P是一個重要的第二信使,能動員Ca2+離子的釋放和活化多種酶類;在細胞外,S1P可以通過與細胞表面特異性受體EDGs結(jié)合,活化多種信號通路,進而調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷移和分化等多種生命活動。

我們的研究結(jié)果顯示,K562/Ima細胞中ERK的磷酸化程度高于K562細胞。無論是對于K562細胞還是K562/Ima細胞,棘霉素都對ERK和AKT有不同程度的抑制作用。

綜上所述,棘霉素不但能抑制K562細胞凋亡,也能抑制K562/Ima細胞的凋亡,IC50分別為0.82μg/L和0.87μg/L。機制可能與抑制ERK和AKT的磷酸化有關,對K562/Ima抑制作用可能還與抑制SPK的活性有關。另外,從實驗中也可以看出伊馬替尼的耐藥機制可能與ERK的磷酸化程度高、SPK表達高有關,這也與前期的研究相一致[9],對棘霉素的研究有望為CML的治療提供新的思路。

[1]安明榜.格列衛(wèi)(甲磺酸伊馬替尼)——一個里程碑式的發(fā)現(xiàn)[J].藥學與臨床研究,2010,18(2):101.

[2]John M,Goldman.Chronic myeloid leukemia-still a few questions[J].Experimental Hematology,2004,32:2―10.

[3]Olivera A,Kohama T,Tu Z,et al.Purification and characterization of rat kidneysphingosine kinase[J].J Biol Chem,1998,273:12576.

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[5]Boulton T G,Nye S H,Robbins D J,et al.ERKs:a family of proteinserine/threonine kinases that are activated and tyrosine phosphorylated inresponse to insulin and NGF[J].Cell,1991,65(4):663―675.

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[8]Persad S,Attwell S,Gray V,et al.Regulation of protein kinase B/Akt serine 473 phosphorylation by integrin linked kinase:critical roles for kinase activity and amino acids arginine 211 and serine 343[J].J Biol Chem,2001, 276(29):27462―27469.

[9]許嚴偉,趙小利,王英等.伊馬替尼敏感及耐藥K562細胞P-糖蛋白、缺氧誘導因子和鞘氨醇激酶表達的比較[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2012,47(2):153.

[責任編輯 時 紅]

Effect of echinomycin on ERK，AKT and SPK expression between K562 and K562/Ima cells

XU Yanwei1，LIN Haihong2，DU Gangjun2*
（1.Depɑrtment of Phɑrmɑcy，Luoyɑng Third People's Hospitɑl，Luoyɑng，Henɑn 471002，Chinɑ；2.Phɑrmɑceutiɑl College，Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

ObjectiveThis study was aimed to explore the effect of echinomycin on the K562 and K562/Ima cells.MethodsIn experiments，the cells proliferation was detected by MTT assay.ERK，AKT and SPK were examed by Western blot assay，TLC in K562 and K562/Ima cells，respectively.ResultsThe results revealed the IC50of echinomycin in K562 and K562/Ima were 0.82 mg/L and 0.87 mg/L，respectively.The ERK and AKT were inhited by echinomycin in K562 and K562/Ima.The expression of SPK was up-regulated in K562/Ima cells，and echinomycin on SPK activity in resistant cells had obvious inhibitory effect.ConclusionEchinomycin can inhibits the proliferation of K562 and K562/Ima cells，and its mechanism may be related to inhibition of ERK，AKT and SPK.

echinomycin；K562；resistance；ERK；AKT；SPK

R966

A

1672―7606(2015)04―0232―04

2015-10-30

國家自然科學基金資助項目(30472082)

許嚴偉(1981―),男,河南洛陽人,主管藥師,從事腫瘤藥理學及臨床藥理學研究工作。

*通信作者:杜鋼軍(1971―),男,河南開封人,博士,教授,從事腫瘤藥理學研究工作。