許嚴(yán)偉,林海紅,杜鋼軍*

(1.洛陽市第三人民醫(yī)院藥劑科,河南洛陽471002;2.河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開封475004)

棘霉素對KBV200細(xì)胞作用的初步研究

許嚴(yán)偉1,林海紅2,杜鋼軍2*

(1.洛陽市第三人民醫(yī)院藥劑科,河南洛陽471002;2.河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開封475004)

目的初步研究棘霉素(echinomycin)對KBV200細(xì)胞(耐長春新堿的口腔癌細(xì)胞)的作用及其作用機(jī)制。方法采用MTT法及流式細(xì)胞儀分別檢測KBV200細(xì)胞的增殖和凋亡;用同位素?fù)饺搿estern blot、RT-PCR等方法分別檢測鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)。結(jié)果棘霉素可誘導(dǎo)KBV200細(xì)胞的凋亡,流式結(jié)果出現(xiàn)DNA亞二倍體凋亡峰;棘霉素對鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)有不同程度的抑制作用。結(jié)論棘霉素對KBV200細(xì)胞有細(xì)胞毒作用,其作用機(jī)制與抑制鞘氨醇激酶、P-糖蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)有關(guān)。

棘霉素;KBV200;鞘氨醇激酶;P-糖蛋白;缺氧誘導(dǎo)因子

腫瘤在人類死亡的主要疾病中居第2位,近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。盡管目前已有多種治療腫瘤的方法問世,由于腫瘤早期不易被發(fā)現(xiàn)的特點(diǎn),化療在腫瘤的治療中一直處于主導(dǎo)地位。由于腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐藥性的產(chǎn)生,導(dǎo)致臨床化療藥物的應(yīng)用受到一定程度的影響。因此,開發(fā)或者研究新型的、能克服化療耐藥性的藥物是現(xiàn)在腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。

棘霉素是從放線菌代謝物中分離得到的一種具有細(xì)胞毒作用的抗生素,它通過與DNA結(jié)合后可以抑制RNA的合成[2]。研究[3]表明,棘霉素對于多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用,例如黑色素瘤細(xì)胞及前列腺、中樞神經(jīng)、結(jié)腸、乳腺、卵巢腫瘤細(xì)胞等。棘霉素對白血病細(xì)胞的生長已有報道[4],但棘霉素對耐長春新堿(Vincristine,CVR)KBV200的研究還未見報道。以我們實驗室篩選的棘霉素(純度＞92.3%,采用HPLC法)為研究對象,初步研究棘霉素對KBV200細(xì)胞的抗腫瘤作用及其作用機(jī)制,報道如下。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株

KBV200細(xì)胞由中國科學(xué)院生物物理研究所惠贈,用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素各1×105U/L的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃,體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中,實驗時選用對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2 試劑與藥品

RPMI1640、MTT、ATP和鞘氨醇為Sigma產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;P-gp抗體為Sant Cruz公司產(chǎn)品;(γ-32P)ATP購自北京福瑞生物工程公司;其他試劑皆為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 儀器

100級潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn));TDL-50B型臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn));XD-101型倒置生物顯微鏡(南京江南光電集團(tuán)股份有限公司);ELX800型酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK);FACScalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司);PCR儀和BIO-RAD垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法>

2.1 MTT檢測

取對數(shù)生長期的KBV200細(xì)胞,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化,調(diào)細(xì)胞數(shù)5×104個/m L, 100μL/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后加含不同濃度棘霉素(設(shè)空白對照組)的培養(yǎng)基100μL/孔,每組6個復(fù)孔。48 h后,除去培養(yǎng)基,加MTT,含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 g/L的PBS 100μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后除去孔內(nèi)的液體,加入DMSO 100μL/孔,振蕩10 min。在酶標(biāo)儀上570 nm處測吸光度(OD),實驗重復(fù)測算3次。按下列公式計算細(xì)胞的存活率:存活率(%)=給藥孔平均OD值/對照孔平均OD值×100%。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期KBV200細(xì)胞,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化,調(diào)細(xì)胞數(shù)3×105個/m L,以3 m L/瓶接種于培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)24 h后加補(bǔ)充含不同濃度棘霉素的培養(yǎng)基3 m L/瓶,每組3個復(fù)瓶。48 h后終止培養(yǎng),消化并收集細(xì)胞,PBS洗2次,體積分?jǐn)?shù)70%冷乙醇固定30 min。PBS洗滌2次后加入Rnase酶消化10 min,1 500 r/min離心5 min,棄上清液,PBS重懸后加碘化丙錠(終濃度20 mg/L)染色15 min,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

2.3 γ-32P法檢測SPK的活性

參照文獻(xiàn)[5],收集細(xì)胞濃度約為5×106個/m L的KBV200細(xì)胞,離心后加入細(xì)胞裂解緩沖液,凍融裂解3次;4℃,14 000 g離心20 min,收集上清液,蛋白定量后取45μL樣品和Sphingosine(溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%Triton X-100中)混勻;在同位素室內(nèi)加入2.5μL/管(32P)ATP(10μCi,20 mmol/L)37℃反應(yīng)10 min;加入1 mol/L的HCl 5μL和氯仿0.2 m L,氯仿∶甲醇∶鹽酸(體積比為100∶200∶1)劇烈振蕩,終止反應(yīng)。再加入氯仿60μL和2 mol/L氯化鉀60μL,12 000 g離心5 min;棄去水相,取15μL有機(jī)相樣品點(diǎn)樣于硅膠底線上,于層析液中展開40 min左右;放射自顯影;掃描結(jié)果,用圖像分析軟件(scion image)分析光密度。

紫杉醇近年來被廣泛應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌等惡性腫瘤治療。但由于其過敏反應(yīng)發(fā)生率較高，占39%，其中嚴(yán)重過敏反應(yīng)發(fā)生率為2%，從而使治療被迫中止，這樣不僅影響了患者治療，而且造成經(jīng)濟(jì)上嚴(yán)重?fù)p失。2010年1月—2011年4月我院門診輸液中心腫瘤患者在接受紫杉醇治療過程中發(fā)生了多例過敏反應(yīng)，其中34例過敏反應(yīng)者，經(jīng)對癥處理與抗過敏治療后，繼續(xù)輸注紫杉醇藥液，順利完成了化療療程?，F(xiàn)將臨床觀察與護(hù)理報道如下。

2.4 Western Blot法檢測P-gp蛋白

將從不同濃度棘霉素作用的KBV200細(xì)胞中提取的10μg蛋白樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,進(jìn)行免疫印跡分析。過程如下:用脫脂牛奶對膜進(jìn)行封閉,加入1∶1 000稀釋的抗P-gp山羊抗體,常溫孵育2 h,用含體積分?jǐn)?shù)0.1%Tween 20 TBS洗膜3次,加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊二抗,常溫孵育45 min,用體積分?jǐn)?shù)0.1%Tween 20 TBS洗膜3次,加入發(fā)光劑,曝光顯影。

2.5 HIF-1αm RNA的表達(dá)

采用RT-PCR,用Trizol試劑分別提取不同棘霉素作用的KBV200細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。目的基因HIF-1α與內(nèi)參β-actin的引物由上海生工合成。HIF-1α引物序列:上游5’-TGAGGCTCACCATCAGTTAT-3’,下游5’-TAACCCCATGTATTTGTTC-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物為247 bp。β-actin引物序列:上游5’-AACCCTAAGGCCAACAGTGAAAAG-3’,下游5’-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物為261 bp。擴(kuò)增條件:94℃變性5 min;94℃1 min, 50℃1 min,72℃2 min,循環(huán)35次;72℃延伸1 min,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后掃描成像[6]。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

不同濃度的棘霉素對體外培養(yǎng)的KBV200細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用,且抑制作用隨藥物濃度的增加而增加(見圖1)。經(jīng)棘霉素處理的細(xì)胞出現(xiàn)典型的亞二倍體/凋亡峰,隨著藥物濃度的升高,凋亡率逐漸增加。在棘霉素濃度為200μg/L時,細(xì)胞凋亡現(xiàn)象最為顯著(見圖2)。

圖1 棘霉素對KBV200細(xì)胞的抑制作用

圖2 棘霉素誘導(dǎo)的KBV200細(xì)胞凋亡

3.2 對SPK活性的影響

γ-32P法檢測顯示,隨著棘霉素濃度的增加,對SPK的活性的影響逐漸增大(見圖3)。

圖3 棘霉素對SPK活性的影響

3.3 對P-gp蛋白活性的影響

Western Blot法檢測P-gp蛋白顯示,不同濃度棘霉素對KBV200細(xì)胞作用呈正相關(guān)關(guān)系(見圖4)。

圖4 棘霉素對KBV200細(xì)胞中P-gp蛋白的影響

3.4 棘霉素對KBV200細(xì)胞中HIF-1α的影響

T-PCR檢測HIF-1αm RNA結(jié)果見圖5。

圖5 棘霉素對KBV200細(xì)胞中HIF-1α的影響

4 討論

KBV200細(xì)胞是以對VCR敏感的KB細(xì)胞為親本,通過誘變劑甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate)刺激,然后在培養(yǎng)液中加入濃度遞增的VCR誘導(dǎo)而得。在VCR為200 nmol/L生長良好,對VCR耐藥約是KB細(xì)胞的100倍。其耐藥機(jī)制主要與P-gp過度表達(dá)有關(guān)[7],是研究多藥耐藥的經(jīng)典細(xì)胞株。P-gp是一種相對分子質(zhì)量為170 000U的跨膜糖蛋白,屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一。Juliano和Ling[8]首先在秋水仙堿耐藥的中國倉鼠卵巢中發(fā)現(xiàn)P-gp,其主要作用是將藥物或其他化學(xué)物質(zhì)排出細(xì)胞外,防止機(jī)體對有害物質(zhì)的吸收和介導(dǎo)物質(zhì)的輸出,從而保護(hù)大腦、睪丸、胎兒和骨髓等重要組織和器官。作為一種能量依賴性藥物外排泵,P-gp通過ATP供能,將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外,從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,既是機(jī)體生理狀態(tài)下的自身防御保護(hù)機(jī)制,也是產(chǎn)生腫瘤多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)的主要原因之一[9]。

鞘氨醇激酶是一種高度保守的脂類激酶,它可激活鞘氨醇(Sp)而生成磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)。細(xì)胞內(nèi)S1P的水平受SPK活性的調(diào)節(jié)。S1P是一個與細(xì)胞多種功能有關(guān)的重要信號分子,具有多種生物學(xué)功能,包括促增殖作用、抗凋亡作用及誘導(dǎo)細(xì)胞遷移等[10]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的活性主要取決于HIF-1α亞基的活性和表達(dá),HIF-1α蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性主要受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)。是人體組織自動動態(tài)平衡的一個主要調(diào)節(jié)者。轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞的存活、適應(yīng)、無氧代謝、免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子分泌、血管生成等多種基因有關(guān),尤其在腫瘤細(xì)胞的存活中有著重要的作用[11]。

我們選用KBV200細(xì)胞株為研究對象,觀察不同濃度棘霉素處理后KBV200細(xì)胞生長抑制率和凋亡情況,以及對SPK、P-gp、HIF-1α表達(dá)的改變,結(jié)果顯示,棘霉素對KBV200細(xì)胞的存活有較為明顯的抑制作用,并可明顯誘導(dǎo)KBV200細(xì)胞凋亡,不同濃度的棘霉素對KBV200細(xì)胞中的SPK、P-gp、HIF-1α均呈現(xiàn)抑制作用,并且棘霉素的抑制作用與其劑量呈正相關(guān)關(guān)系。

綜上所述,棘霉素對KBV200細(xì)胞生長的抑制作用及其機(jī)制研究為解決口腔鱗癌對長春新堿的耐藥提供了新的治療方案,該實驗僅僅是研究棘霉素作用機(jī)制的一部分,對腫瘤耐藥的研究及探索工作正在進(jìn)行中。

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[責(zé)任編輯 時 紅]

The Primary research of Echinomycin on KBV200 cell line

XU Yanwei1，LIN Haihong2，DU Gangjun2*
（1.Depɑrtment of Phɑrmɑcy，Luoyɑng Third People's Hospitɑl，Luoyɑng，Henɑn 471002，Chinɑ；2.Phɑrmɑcologicɑl College of Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

ObjectiveTo research the action and mechanism of echinomycin in KBV200 cell line.MethodsThe proliferation and cell cycle of KBV200 cells were determined by MTT assay and flow cytometry，respectively.TLC，Western-blot and RT-PCR were used to detect the expressions SPK，P-gp and HIF-1αon KBV200 cells，respectively.ResultsEchinoderm can induce apoptosis of KBV200 cells，and have different degrees of inhibition effect on expression of SPK，P-gp，HIF-1.ConclusionEchinomycin has better the cytotoxic effect on KBV200 cells，and the mechanism of action is related to inhibition of expression SPK，P-gp and HIF-1α.

echinoderm；KBV200；SPK；P-gp；HIF-1α

R966

A

1672―7606(2015)04―0236―04

2015-10-30

國家自然科學(xué)基金資助項目(30472082)

許嚴(yán)偉(1981―),男,河南洛陽人,主管藥師,從事腫瘤藥理學(xué)的研究工作。

*通信作者:杜鋼軍(1971―),男,河南開封人,博士,教授,從事腫瘤藥理學(xué)研究。