許嚴(yán)偉,林海紅,杜鋼軍*

(1.洛陽(yáng)市第三人民醫(yī)院藥劑科,河南洛陽(yáng)471002;2.河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開(kāi)封475004)

棘霉素對(duì)耐伊馬替尼K562細(xì)胞SPK及P-gp表達(dá)的影響

許嚴(yán)偉1,林海紅2,杜鋼軍1*

(1.洛陽(yáng)市第三人民醫(yī)院藥劑科,河南洛陽(yáng)471002;2.河南大學(xué)藥學(xué)院,河南開(kāi)封475004)

目的研究棘霉素對(duì)耐伊馬替尼K562細(xì)胞SPK及P-gp表達(dá)的影響。方法MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,同位素?fù)饺霗z測(cè)SPK的活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的P-gp表達(dá)。結(jié)果棘霉素對(duì)K562和耐伊馬替尼細(xì)胞的IC50分別為0.82μg/L和0.87μg/L;棘霉素對(duì)耐藥細(xì)胞中的SPK和P-gp活性有抑制作用;通過(guò)抑制SPK的活性可以下調(diào)P-gp的表達(dá)。結(jié)論棘霉素對(duì)敏感及耐藥K562細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用,抑制K562/Ima存活的機(jī)制可能與影響細(xì)胞中SPK的表達(dá),并通過(guò)下調(diào)SPK進(jìn)一步影響P-gp的表達(dá),從而增加藥物在細(xì)胞內(nèi)的累積濃度有關(guān)。

棘霉素;K562/Ima;鞘氨醇激酶;P糖蛋白

由多藥耐藥蛋白P糖蛋白P-gp介導(dǎo)的藥物泵出增多、細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低在多種抗腫瘤藥物耐藥中得到證實(shí),伊馬替尼耐藥的出現(xiàn)與P-gp也有著巨大的關(guān)系[1]。P-gp是一種相對(duì)分子質(zhì)量為170 000U的跨膜糖蛋白,屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一。Juliano和Ling[2]首先在秋水仙堿耐藥的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢中發(fā)現(xiàn)P-gp,其主要作用是將藥物或其他化學(xué)物質(zhì)排出細(xì)胞外,防止機(jī)體對(duì)有害物質(zhì)的吸收和介導(dǎo)物質(zhì)的輸出,從而保護(hù)大腦、睪丸、胎兒和骨髓等重要組織和器官。作為一種能量依賴性藥物外排泵, P-gp通過(guò)ATP供能,將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外,從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,既是機(jī)體生理狀態(tài)下的自身防御保護(hù)機(jī)制,也是產(chǎn)生腫瘤多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)的主要原因之一[3]。

自Rhoads[4]首次描述MDR以來(lái),腫瘤耐藥已經(jīng)涉及到臨床常用的多種抗癌藥物。TILLmer等[5]通過(guò)逐漸增加K562細(xì)胞中P-gp的表達(dá)來(lái)觀察細(xì)胞內(nèi)伊馬替尼含量的變化,結(jié)果顯示,隨著P-gp表達(dá)的增強(qiáng),細(xì)胞中伊馬替尼的濃度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。證明了伊馬替尼的耐藥和P-gp有巨大的關(guān)系。

SPK-S1P信號(hào)通路是近年來(lái)被許多研究者所重視的一條有關(guān)細(xì)胞存亡、增殖的信號(hào)途徑。鞘氨醇激酶(SPK)是一種高度保守的脂類激酶,它可激活鞘氨醇(Sp)而生成磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)。細(xì)胞內(nèi)S1P的水平受SPK活性的調(diào)節(jié)。S1P是一個(gè)與細(xì)胞多種功能有關(guān)的重要信號(hào)分子,具有多種生物學(xué)功能,包括促增殖作用、抗凋亡作用及誘導(dǎo)細(xì)胞遷移等[6]。

目前,SPK-S1P信號(hào)與K562細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系以及與P-gp的關(guān)系沒(méi)有很明確的報(bào)道。因此,本文旨在于觀察棘霉素對(duì)SPK和P-gp的影響及探討兩者之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

細(xì)胞株:K562細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存,用時(shí)復(fù)蘇; K562耐伊馬替尼細(xì)胞(K562/Ima)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所。K562和K562/Ima細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基,于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

主要試劑:兔抗山羊P-gp抗體(Sant Cruz公司產(chǎn)品);鞘氨醇、MTT、ATP(Sigma公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?γ-32P)ATP購(gòu)自北京福瑞生物工程公司。

儀器:FACScalibur流式細(xì)胞儀,購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 MTT檢測(cè)

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清培養(yǎng)基將細(xì)胞配成細(xì)胞濃度為(4～5)× 105/m L的細(xì)胞懸液,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 180μL/孔,待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)后。各孔加入棘霉素20μL,使其終濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、3.0μg/L,并設(shè)空白對(duì)照組;K562組其終濃度分別0.03、0.01、0.1、0.3、1.0、3.0 mg/L,K562/Ima組分別為0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、20.0 mg/L。37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h;棄掉培養(yǎng)基,每孔加入150μL DMSO,振蕩15 min,570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)光吸收值。以加藥孔OD值與對(duì)照孔OD值的百分比為細(xì)胞存活率,根據(jù)細(xì)胞存活率和藥物濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系用SPSS軟件求藥物的IC50。

細(xì)胞的耐藥倍數(shù)計(jì)算方法:

耐藥倍數(shù)(RF)=耐藥細(xì)胞(IC50)/敏感細(xì)胞(IC50)

1.3 SPK的活性檢測(cè)[7]

不同濃度的棘霉素作用K562/Ima細(xì)胞12 h后(設(shè)空白對(duì)照組),收集細(xì)胞于緩沖液中,離心,凍融裂解3次;4℃,14 000 g離心20 min,收集上清;取180μL和10μL 1 mmol/L Sphingosine(溶解于體積分?jǐn)?shù)為5%的Ttiton X-100中)混勻;加入10μL (32P)ATP(10μCi,20 mmol/L)含MgCl2200 mmol/L,37℃反應(yīng)10 min;加入1 mol/L HCl 20μL和氯仿0.8 m L,氯仿∶甲醇∶HCl(體積比100∶200∶1),猛烈振蕩,終止反應(yīng);加入氯仿60μL和2 mol/L KCl 60μL,12 000g離心5 min;此時(shí)水相和有機(jī)相分離,棄去水相,取15μL有機(jī)相樣品點(diǎn)樣于硅膠板上,于層析液中展開(kāi)40 min;放射自顯影;掃描結(jié)果,用圖像分析軟件Scionimɑge分析光密度。

1.4 細(xì)胞表面P-gp的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞收集于離心管中,1 000轉(zhuǎn)離心5 min后用冰冷的PBS洗細(xì)胞2次;將細(xì)胞(5×105～1×106)沉淀重懸于50μL的PBS中,加入適當(dāng)比例稀釋的兔抗山羊P-gp抗體(10μL/管),4℃孵育1 h,期間間歇搖晃細(xì)胞;用含體積分?jǐn)?shù)1%血清PBS洗細(xì)胞3次(每次加滿離心管);將細(xì)胞沉淀重懸于50μL的PBS中,加入2.5μL稀釋的FITC標(biāo)記的二抗,4℃孵育40 min;將細(xì)胞沉淀重懸于250μL的PBS中,加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛,混合均勻,保存于4℃冰箱,待流式檢測(cè)用。至少檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞。

試驗(yàn)共分2組:第1組:向K562/Ima中加入棘霉素,使其終濃度為3.0μg/L,分別作用3、6、12、24、48 h。第2組:向K562/Ima細(xì)胞中加入SPK抑制劑DMS(N,N-dimethylsphingosine),0 u M(control),1.0 u M,2.5 u M和5.0 u M,處理12 h。

2 結(jié)果

2.1 K562/Ima相對(duì)于K562的RF

K562/Ima相對(duì)于K562的RF為24。棘霉素對(duì)K562細(xì)胞及K562/Ima細(xì)胞的IC50分別為0.82μg/L和0.87μg/L。對(duì)K562/Ima中SPK活性的影響,見(jiàn)圖1。

圖1 γ-32 P法檢測(cè)K562/Ima細(xì)胞中SPK的活性

2.2 棘霉素對(duì)耐藥細(xì)胞中P-gp表達(dá)的影響

在K562/Ima細(xì)胞試驗(yàn)組中,陽(yáng)性對(duì)照組P-gp蛋白的表達(dá)細(xì)胞百分率為31.63%。棘霉素作用3、6、12、24、48 h后。Pgp蛋白表達(dá)細(xì)胞百分率分別被下調(diào)到8.69%、2.34%、1.33%、3.22%、8.66%,而敏感的K562細(xì)胞陰性對(duì)照組為0.3%,見(jiàn)圖2。

2.3 SPK對(duì)K562/Ima細(xì)胞P-gp表達(dá)的影響

(見(jiàn)圖3)

圖2 棘霉素對(duì)K562/Ima細(xì)胞P-gp表達(dá)的影響

圖3 加入SPK抑制劑后K562/Ima細(xì)胞中P-gp的表達(dá)

3 討論

甲磺酸―伊馬替尼(格列衛(wèi))作為靶向治療慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)的藥物,曾被譽(yù)為抗癌藥物史上里程碑的發(fā)現(xiàn)。但是,由于大部分患者對(duì)伊馬替尼的應(yīng)答期較短[8],隨著伊馬替尼作用時(shí)間的延長(zhǎng),耐藥導(dǎo)致的治療失敗的現(xiàn)象越來(lái)越常見(jiàn)。耐藥問(wèn)題已經(jīng)成為制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。因此,多藥耐藥產(chǎn)生的機(jī)制、尋找有效逆轉(zhuǎn)方法和開(kāi)發(fā)新的作用機(jī)制的藥物是腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

K562/Ima是耐伊馬替尼的白血病細(xì)胞,也是研究臨床耐藥白血病的經(jīng)典細(xì)胞模型。為了探討棘霉素對(duì)K562/Ima細(xì)胞SPK和P-gp的影響,我們首先通過(guò)(γ-32P)摻入實(shí)驗(yàn)的方法,用不同濃度棘霉素(1.0、2.0、4.0μg/L)作用K562/Ima細(xì)胞12 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在K562/Ima細(xì)胞中,隨著棘霉素劑量的增加SPK的表達(dá)逐漸下降。與此同時(shí),我們以流式細(xì)胞儀(FACS)的方法檢測(cè)了棘霉素是否能降低耐藥細(xì)胞中P-gp的表達(dá)。FACS定量分析結(jié)果顯示,在K562/Ima細(xì)胞中, P-gp表達(dá)下降的趨勢(shì)非常明顯。陽(yáng)性對(duì)照組P-gp蛋白的表達(dá)細(xì)胞百分率為31.63%。棘霉素作用3、6、12、24、48 h后。P-gp蛋白表達(dá)細(xì)胞百分率分別下調(diào)到8.69%、2.34%、1.33%、3.22%、8.66%,而不耐藥的K562細(xì)胞陰性對(duì)照組為0.3%。由此可見(jiàn),棘霉素可以很好地下調(diào)K562/Ima細(xì)胞中P-gp的表達(dá)。為了進(jìn)一步探索P-gp和S1P之間是否存在關(guān)系,我們向細(xì)胞中加入了SPK抑制劑DMS,作用12 h后流式檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),1.0μM的DMS已經(jīng)對(duì)P-gp的表達(dá)起到了較好的下調(diào)作用,從25%下調(diào)到15%左右,加入5.0μM后下調(diào)到5.44%。

綜上所述,由于棘霉素不但能下調(diào)K562/Ima細(xì)胞中SPK的表達(dá),而且能顯著下調(diào)耐藥細(xì)胞中P-gp的表達(dá),下調(diào)P-gp的機(jī)制可能是由SPK的介導(dǎo)調(diào)控產(chǎn)生的。這對(duì)于CML的耐藥治療及其機(jī)理的研究可能有較大的意義。

[1]朱煥玲,劉霆,孟文彤,等.體外誘導(dǎo)K562細(xì)胞伊馬替尼耐藥及其機(jī)理的初步探討[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2007,38(1):22―26.

[2]Juliano R L,Ling V.A surface glycoproein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants. Biochim Biophys Acta,1976,455(1):152―162.

[3]聞鎳,張雙慶,朱凌.P-糖蛋白最新研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥事,2011,25(7):718―720.

[4]Rhoads C D.Nitrogen mustards intreatment of neoplastic disease[J].JAMA,1946,21:656―677.

[5]TIllmer,Mschaich U,Platzbecker,et al.P-glycoproteinmediated drug efflux is a resistance mechanism of chronic myelogenous leukemia cells to treatment with imatinib mesylate[J].Leukemia,2004,18:401―408.

[6]許嚴(yán)偉,趙小利,王英,等.伊馬替尼敏感及耐藥K562細(xì)胞P-糖蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子和鞘氨醇激酶表達(dá)的比較[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,47(2):153―155.

[7]Olivera A,Kohama T,Tu Z,et al.Purification and characterization of rat kidney sphingosine kinase[J].J Biol Chem,1998,273:12576.

[8]John M G.Chronic myeloid leukemia-still a few questions [J].Experimental Hematology,2004,32:2―10.

[責(zé)任編輯 時(shí) 紅]

Effect of echinomycin on SPK and P-gp expression in K562/Ima cells

XU Yanwei1，LIN Haihong2，DU Gangjun1*
（1.Depɑrtment of Phɑrmɑcy，Luoyɑng Third People's Hospitɑl，Luoyɑng，Henɑn 471002，Chinɑ；2.Phɑrmɑceutiɑl College，Henɑn University，Kɑifeng，Henɑn 475004，Chinɑ）

ObjectiveThis study was aimed to explore the effect of echinomycin on SPK and P-gp in K562/Ima cells.MethodsIn experiments，thes cell proliferation was detected by MTT assay.SPK and P-gp were examed by TLC and FACSin K562/Ima cells，respectively.ResultsThe results revealed the IC50of echinomycin in K562 and K562/ Ima were 0.82μg/L and 0.87μg/L，respectively.The SPK and P-gp were inhited by echinomycin in K562/Ima. The expression of P-gp was inhibited by down-regulating the activity of SPK.ConclusionEchinomycin can inhibit the proliferation of K562 and K562/Ima cells，and its mechanism of inhibiting K562/Ima may be related to inhibition of SPK，and the expression of P-gp was inhibited by down-regulating the activity of SPK，further increasing cumulative concentration effect of drug in K562/Ima cells.

echinomycin；K562/Ima；SPK；P-gp

R966

A

1672―7606(2015)04―0240―04

2015-10-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30472082)

許嚴(yán)偉(1981―),男,河南洛陽(yáng)人,碩士,主管藥師,從事腫瘤藥理學(xué)和臨床藥理學(xué)研究工作。

*通信作者:杜鋼軍(1971―),男,河南開(kāi)封人,博士,教授,主要從事中藥抗腫瘤藥理學(xué)研究工作。