（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.上海南方模式生物研究中心，上海 201203）

小鼠性激素結(jié)合球蛋白條件基因打靶載體的構(gòu)建

王越1，金鎮(zhèn)1，孫磊1，鄭晉華2

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.上海南方模式生物研究中心，上海 201203）

目的構(gòu)建小鼠性激素結(jié)合球蛋白（Shbg）條件基因打靶載體。方法運(yùn)用ET克隆的方法構(gòu)建Shbg基因第4-7號外顯子兩側(cè)插入loxp位點(diǎn)的條件性剔除載體。首先以BAC DNA為模板克隆出Shbg及其上、下游基因并打靶質(zhì)粒載體（pBR322-MKAB），利用該質(zhì)粒和BAC克隆，通過同源重組方式，獲得套取質(zhì)粒（pBR322-Shbg-Re）；再分別以PL452及PL451為模板擴(kuò)增出含Neo片段，經(jīng)過再一輪的Red/ET重組成功實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除打靶載體（pBR322-MK-SHBG-cko）的構(gòu)建。結(jié)果經(jīng)多個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測序證實(shí)，構(gòu)建的pBR322-MK-AB、pBR322-Shbg-Re、SHBG-Ln重組質(zhì)粒和Shbg條件基因打靶載體（pBR322-MK-SHBG-cko）結(jié)構(gòu)正確，與設(shè)計(jì)相符。結(jié)論成功構(gòu)建了小鼠Shbg條件基因打靶載體，為后續(xù)Shbg基因條件敲除小鼠模型的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

性激素結(jié)合球蛋白；條件性基因敲除；載體；Red/ET重組

性激素結(jié)合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）是一種能結(jié)合性激素甾體的球蛋白，主要由肝臟組織細(xì)胞合成和分泌，在其他組織中如睪丸、腦、卵巢、胎盤、子宮內(nèi)膜和乳腺癌組織也有SHBG基因表達(dá)［1］。妊娠期糖尿病的發(fā)病機(jī)制與2型糖尿病相似，妊娠期胰島素抵抗的增加和胰島β細(xì)胞分泌的減少也是其發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)。目前認(rèn)為SHBG的低水平是2型糖尿病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是高胰島素血癥性胰島素抵抗的一個(gè)標(biāo)志［2］。最近研究發(fā)現(xiàn)，SHBG基因啟動(dòng)子（TAAAA）_n重復(fù)多態(tài)與糖代謝異常有關(guān)，這種重復(fù)多態(tài)性可以影響血液循環(huán)中的SHBG水平，對易發(fā)生糖尿病等并發(fā)癥的高危個(gè)體的早期識(shí)別具有重要的價(jià)值［3，4］。我們通過RNA干擾與基因沉默技術(shù)研究了胎盤滋養(yǎng)層合體細(xì)胞中SHBG的自分泌作用機(jī)制；通過胎盤滋養(yǎng)層合體細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立，研究了SHBG對其胰島素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和胰島素抵抗的影響［5～7］。

目前利用基因敲除技術(shù)觀察候選基因在產(chǎn)生胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷中的作用已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［8］，國際上尚無SHBG基因敲除動(dòng)物模型的研究。Red/ET重組（Red/ET recombination）技術(shù)因不涉及酶切、連接反應(yīng)，具有高效率，且不會(huì)引入突變，為構(gòu)建打靶載體提供了一種新的可靠的方法［9］。為此我們采用優(yōu)化的Red/ET同源重組技術(shù)，構(gòu)建Shbg條件性基因敲除載體，為進(jìn)一步獲得正確同源重組的胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）和建立Shbg條件基因敲除小鼠模型奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株：含Shbg的BAC宿主菌購自BAC PAC資源中心（Children′s Hospital akland Research Institute）。質(zhì)粒PL-452、菌株EL-350由Liu Pengtao（英國劍橋Wellcome Trust S-anger Institute）惠贈(zèng)。含Red/ET重組酶基因的pSC101-BAD-γβα-A -tet質(zhì)粒由張友明（德國Gene Bridges GmbH）惠贈(zèng)。大腸桿菌D-H5α株為博大泰克產(chǎn)品。質(zhì)粒pBR322-MK為上海南方模式生物研究中心改建。

1.1.2 酶及主要試劑：各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶及PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司。L-阿拉伯糖、氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素等常規(guī)化學(xué)試劑主要購自Sigma和上?；瘜W(xué)試劑公司。DNA片段回收試劑盒購自華舜生物公司。BAC質(zhì)粒DNA提取試劑盒購于Qiagen公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。所有PCR引物合成和測序均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.1.3 引物：由上海生工生物技術(shù)公司合成，打靶載體構(gòu)建用引物：SHBG-A1CCCAAGCTTGTGGGTTGCTATGTGGGTTCCG；SHBG-A2 GCAAATGGTAC CCTGGAGAGAGGGCTCAGTGGTT；SHBG-B1 TAA ACAGGTACCAGGAGTGAGTGGACCGCTGT；SHBGB2 CGCGGATCCGTGGGAGGCAATTCGAGGTCTT；SHBG-L1 CTGAGGGGAACGAGATCACTGGGAGGA AAGAGAGGGGTGACTTGTGGGGTGTTGCTCAAGC ACTGGTCGACGAATTCCTGCAGCCCAATTC；SHBG -L2 ACAAGCCTGCCCCCTTTCTATTCCACTTTTATT TTCTAGTTATAAAACCACAGGCCTCAGGCACTGGA TCCCCTCGAGGGACCTA；SHBG-F1 TGGGAAGTG GCTATTCTTGTCCTAGTTTCATCAGATGGGAATC

CCAAGGCTGAGTCAGTATGTCAGAATTCCGAAGTT CCTATTC；SHBG-F2 AGCCGAGTACAGCTGAAA GAAGATGCTCTGGAACATGGGTGCTTGGCTCACTC AGACTGTGTCACGGATCCACCTAATAACTTCG。

1.2 設(shè)計(jì)

1.2.1 Shbg基因的生物信息學(xué)分析及同源臂的設(shè)計(jì)：通過分析小鼠Shbg基因的全長外顯子起始密碼子以及全基因的長度及編碼蛋白情況，綜合考慮決定要進(jìn)行敲除的基因片段和設(shè)計(jì)同源臂。

1.2.2 同源臂套取擴(kuò)增：

1.2.2.1 上下游同源臂A、B的擴(kuò)增 在PCR引物末端設(shè)計(jì)好酶切位點(diǎn)，以含Shbg的BAC DNA為模板，PCR擴(kuò)增Shbg基因外上游基因片段A同源臂、Shbg基因外下游基因片段B同源臂。PCR引物為：A臂：SHBG-A1和SHBG-A2，長度為372 bp；B臂：SHBGB1和SHBG-B2，長度為398 bp。常規(guī)PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.25%瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得372 bp/398 bp的目的基因片段。

1.2.2.2 含neo同源臂片段的擴(kuò)增 同樣方法，以PL452質(zhì)粒為模板DNA，SHBG-L1，SHBG-L2為引物，PCR直接擴(kuò)增出含Neo的L片段（即L1-neo-L2片段）。以PL451質(zhì)粒為模板DNA，SHBG-F1，SHBGF2為引物，PCR直接擴(kuò)增出含Neo的F片段（即F1-neo-F2片段）。

1.2.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備：

1.2.3.1 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞制備 將菌液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，冰上放置10 min。4℃，4 000 r/min離心10 min。棄去上清，將管倒置1 min使培養(yǎng)液流盡，用冰上預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液10 mL輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30 min。0～4℃4 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入2 mL預(yù)冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置，即可獲得DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.3.2 EL350感受態(tài)細(xì)胞制備 挑選一EL350克隆，32℃培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接到3 mL的新鮮LB培養(yǎng)液，32℃培養(yǎng)，加10%阿拉伯糖后32℃繼續(xù)培養(yǎng)，制備感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.3.3 BAC感受態(tài)細(xì)胞 制備誘導(dǎo)重組酶表達(dá)的大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，將BAC單克隆常規(guī)轉(zhuǎn)化至其中，通過篩選獲得轉(zhuǎn)入成功的BAC細(xì)胞。將獲得的細(xì)胞在含氨芐青霉素（50 μg/mL）LB板中32℃培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接到3 mL的新鮮LB培養(yǎng)液，32℃培養(yǎng)后迅速移至42℃熱激，迅速冰上冷卻，制備感受態(tài)細(xì)胞。

1.3 方法

1.3.1 同源臂的擴(kuò)增：以BAC DNA為模板擴(kuò)增出所需的同源臂A、B，PCR體系為：模板DNA（BAC質(zhì)粒/菌液）2 μL，10×PCR緩沖液5 μL，dNTP 4 μL，上下游引物各2 μL，rTaq酶1U，DDH2O 36 μL。PCR循環(huán)條件：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s（共30個(gè)循環(huán)）、72℃延伸5 min。同樣方法，以PL452質(zhì)粒為模板DNA擴(kuò)增出含Neo的L片段（即L1-neo-L2片段）。以PL451質(zhì)粒為模板DNA擴(kuò)增出含Neo的F片段（即F1-neo-F2片段）。PCR體系為：模板DNA（PL452/PL451質(zhì)粒）2 μL，10×PCR緩沖液5 μL，dNTP 8 μL，上下游引物各2 μL，rTaq酶：1 U，DDH2O 32 μL。PCR循環(huán)條件：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸2 min（共35個(gè)循環(huán)）、72℃延伸5 min。

1.3.2 套取質(zhì)粒的構(gòu)建：A臂（372 kb）經(jīng)HindⅢ、KpnⅠ雙酶切后連入經(jīng)HindⅢ、KpnⅠ雙酶切后的線性化的pBR322-MK載體中，經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，膠回收，在16℃連接過夜，連接物常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆采用HindⅢ、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，獲得的質(zhì)粒命名為pBR322-MK-A。按照如上操作，再次將B臂（398 kb）經(jīng)KpnⅠ、BamHⅠ雙酶切連入KpnⅠ、BamHⅠ雙酶切后的線性化的pBR322-MK-A載體中，常規(guī)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過篩選獲得的質(zhì)粒命名為pBR322-MK-AB。

1.3.3 轉(zhuǎn)化pSC101-BAD-γβα-A-tet：挑一BAC單克隆，37℃培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接到3 mL的新鮮LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)，制備感受態(tài)，并將pSC101-BAD-γβα-A-tet（ZET-1）轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細(xì)胞，涂至含氯霉素（20 μg/mL）+四環(huán)素（30 μg/mL）LB板，30℃培養(yǎng)過夜。

1.3.4 DNA套取、鑒定：挑取已轉(zhuǎn)ZET-1成功的細(xì)胞，30℃培養(yǎng)過夜，次日以1∶50轉(zhuǎn)接到3 mL的新鮮LB培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)（OD600＜0.2），加L-阿拉伯糖后改至37℃培養(yǎng)，此期間redγ/redβ/redα被誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)誘導(dǎo)后制備感受態(tài)細(xì)胞，方法同上。轉(zhuǎn)化50～100 ng的線性化的pBR322-2S-AB，涂布氨芐板，37℃培養(yǎng)過夜。抽提轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，獲得pBR322-SHBG-Re質(zhì)粒初步酶切鑒定后，進(jìn)一步用PCR方法測序鑒定重組質(zhì)粒。

1.3.5 neo基因第1次靶向插入及篩選：將上述獲得的pBR322-SHBG-Re質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到已制備成功的EL350感受態(tài)細(xì)胞，涂至含氨芐青霉素（50 μg/mL）LB板，32℃培養(yǎng)過夜。將L1-neo-L2片段（200～300 ng）轉(zhuǎn)化到BAC感受態(tài)細(xì)胞，涂至含氨芐青霉素（50 μg/mL）+卡那霉素（15 μg/mL）LB板，32℃過夜。利用介于兩端同源序列之間的線性化位點(diǎn)進(jìn)行線性化的套取載體在EL350中與BAC發(fā)生同源重組，得到SHBG-Ln質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶及測序鑒定。轉(zhuǎn)化陽性SHBG-Ln質(zhì)粒到已制備成功的EL350感受態(tài)細(xì)胞，涂至含氨芐青霉素（50 μg/mL）LB板［卡那霉素（15 μg/mL）LB板做對照］，32℃培養(yǎng)過夜，獲得SHBG-Ln-Cre質(zhì)粒。

1.3.6 neo基因第2次插入：將SHBG-Cre質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到已制備成功的EL350感受態(tài)細(xì)胞，同理轉(zhuǎn)化F1-neo-F2片段（200～300 ng），涂至含氨芐青霉素（50 μg/mL）+卡那霉素（15 μg/mL）LB板，32℃過夜。即可將上述SHBG-Ln-Cre質(zhì)粒與含Neo的F片段共同轉(zhuǎn)入EL350菌株，經(jīng)過同源重組完成第2次插入neo基因，構(gòu)建載體pBR322-MK-SHBG-cko。

1.3.7 純化及打靶載體的鑒定：此時(shí)得到的質(zhì)粒往往混有2種質(zhì)粒（pBR322-MK-SHBG-cko+SHBG-Ln-Cre質(zhì)粒），將酶切鑒定正確的neo插入質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂至含氨芐青霉素（50 μg/mL）LB板或卡那霉素（15 μg/mL）LB板，此過程套取質(zhì)粒被去除，最后獲得pBR322-MK-SHBG-cko載體質(zhì)粒，酶切鑒定并送測序。

2 結(jié)果

2.1 Shbg條件性基因敲除打靶載體同源臂的設(shè)計(jì)

從Ensembl數(shù)據(jù)庫中（http：//www.ensembl.org/ index.html）獲得Shbg基因組序列，根據(jù)基因組序列設(shè)計(jì)打靶載體。小鼠Shbg位于染色體11：69，614，804-69，617，905（-），產(chǎn)生兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本Shbg-001和Shbg-002。Shbg-001由8個(gè)外顯子組成，蛋白質(zhì)翻譯起始于第1外顯子，結(jié)束于最后外顯子，編碼蛋白大小為403aa。Shbg-002由4個(gè)外顯子組成，該轉(zhuǎn)錄本不編碼蛋白。根據(jù)上述信息和基因條件剔除的一般原則，需要選擇剔除核苷酸數(shù)不為3整除的外顯子，剔除外顯子4～7后，此段外顯子缺失后使后繼序列發(fā)生移碼突變，提早出現(xiàn)終止密碼子，使其蛋白翻譯提前終止，使Shbg重要功能域缺失。運(yùn)用ET克隆的方法構(gòu)建Shbg基因第4～7號外顯子兩側(cè)插入loxp位點(diǎn)的條件性剔除載體，步驟如圖1。

2.2 同源臂套取擴(kuò)增及套取

2.2.1 Shbg同源臂擴(kuò)增：設(shè)計(jì)好酶切位點(diǎn)，以含SHBG的BAC DNA為模板，擴(kuò)增其上下游基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得長約372 bp/398 bp的DNA片段，分別命名為同源臂A、同源臂B（圖2）。

圖1 Shbg基因敲除打靶載體設(shè)計(jì)Fig.1 Diagram of the strategy to generate Shbg targeting vector

圖2 同源臂A、同源臂B的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of PCR products of homologous arm A and homologous arm B

2.2.2 含neo同源臂片段的擴(kuò)增：設(shè)計(jì)好酶切位點(diǎn)，以含PL452為模板，以SHBG-L1，SHBG-L2為引物，擴(kuò)增其上下游基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得長約2 kb的L1-neo-L2片段，并含neo、LoxP片段和SalⅠ酶切位點(diǎn)（圖3）。同上述方法，以含PL451為模板，擴(kuò)增出F1-neo-F2片段（圖4）。

圖3 L1-neo-L2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of PCR products of L1-neo-L2

圖4 F1-neo-F2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of PCR products of F1-neo-F2

2.2.3 套取質(zhì)粒的構(gòu)建：在感受態(tài)細(xì)胞中，利用HindⅢ&KpnⅠ雙酶切限制性內(nèi)切酶將A臂克隆至pB-R322-2S質(zhì)粒中，構(gòu)成pBR322-MK-A；同種方法，通過KpnⅠ&BamHⅠ雙酶切將下游基因片段B臂連接到pBR322-MK-A，構(gòu)成pBR322-MK-AB，通過HindⅢ&BamHⅠ雙酶切電泳鑒定（圖5），得到770 bp片段。

2.3 DNA套取、鑒定

挑取已轉(zhuǎn)ZET-1的BAC單克隆制備感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化50～100 ng的線性化的pBR322-MK-AB，涂布氨芐板，37℃培養(yǎng)過夜。抽提轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，獲得pBR322-SHBG-Re質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ酶切，得到兩個(gè)片段，分別為5 668 bp和7 553 bp（質(zhì)粒抽提可能會(huì)存在RNA沒有被完全降解的情況，不影響質(zhì)粒酶切），見圖6。

圖5 pBR322-SHBG-Re酶切的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoresis of PCR products of enzyme digestion of pBR322-SHBG-Re

圖6 pBR322-MK-AB酶切的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoresis of PCR products of enzyme digestion of pBR322-MK-AB

2.4 neo基因第1次靶向插入及篩選

將pBR322-SHBG-Re質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到已制備成功的EL350感受態(tài)細(xì)胞，與BAC經(jīng)同源重組后，得到SHBG-Ln質(zhì)粒，用SalⅠ酶切，得到4個(gè)片段（圖7），分別為7 553 bp、5 668 bp、4 866 bp和2 703 bp。

2.5 pBR322-MK-SHBG-cko測序結(jié)果

Fig.7 SHBG-Ln酶切的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.7 Electrophoresis of PCR products of enzyme digestion of SHBG-Ln

SHBG-Ln-Cre質(zhì)粒與含Neo的F片段共同轉(zhuǎn)入EL350菌株感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過同源重組完成第2 ?次插入neo基因，構(gòu)建載體pBR322-MK-SHBG-cko。pBR322-MK-SHBG-cko質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ酶切，得到3個(gè)片段，分別為7 553 bp、6 764 bp和906 bp；SHBG-Ln-Cre質(zhì)粒SalⅠ酶切，得到3個(gè)片段（圖8），分別為7 553 bp、4 866 bp和906 bp；酶切結(jié)果為2種質(zhì)粒的疊加，應(yīng)為4個(gè)片段（圖8），分別為7 553 bp、6 764 bp、4 866 bp和906 bp。

圖8 pBR322-MK-SHBG-cko酶切的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.8 Electrophoresis of PCR products of enzyme digestion of pBR322-MK-SHBG-cko

2.6 純化及打靶載體的鑒定

考慮pBR322-MK-SHBG-cko耐藥性，將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂至含氨芐青霉素（50 μg/mL）LB板或卡那霉素（15 μg/mL）LB板，套取質(zhì)粒將被去除，最后得到的只是pBR322-MK-SHBG-cko載體質(zhì)粒，經(jīng)SalⅠ酶切，得到3個(gè)片段（圖9），分別為7 553 bp、6 764 bp和906 bp。測序結(jié)果見圖10。

圖9 pBR322-MK-SHBG-cko酶切的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.9 Electrophoresis of PCR products of enzyme digestion of pBR322-MK-SHBG-cko

圖10 pBR322-MK-SHBG-cko的測序圖Fig.10 Sequencing analysis of pBR322-MK-SHBG-cko

3 討論

基因敲除現(xiàn)主要有全基因敲除和條件性基因敲除2種方法。全基因敲除是通過將一段外源DNA序列（多數(shù)情況下是用于藥物篩選的新霉素抗性基因）來替換目標(biāo)基因，進(jìn)而使特定靶基因失活而使其所有組織器官中缺失的技術(shù)。條件性基因敲除主要是通過染色體位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)，例如Cre-LoxP系統(tǒng)和FLP-frt系統(tǒng)插入和重組來實(shí)現(xiàn)的，在待敲除的目標(biāo)DNA序列兩端各插入一個(gè)LoxP（或Frt）序列，得到flox（Flanked by loxP）小鼠，將獲得的flox小鼠與帶有細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre（或Flp）的小鼠交配繁殖，即可獲得在特定細(xì)胞里把目標(biāo)基因不表達(dá)的小鼠，即條件性基因敲除小鼠［10］。其可以實(shí)現(xiàn)時(shí)間和組織特異性的特定基因的缺失表達(dá)，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)［11］。目前對Shbg的研究多集中在細(xì)胞和分子水平及臨床試驗(yàn)上，未曾建立相關(guān)小鼠模型，不除外Shbg具有致死性，故選擇條件性基因敲除。

基因載體的構(gòu)建（即目的基因與運(yùn)載體結(jié)合）是構(gòu)建基因敲除小鼠的第一步，目前比較常用的基因打靶載體構(gòu)建方法主要有兩種：一種是先通過PCR擴(kuò)增各組分利用分子克隆來構(gòu)建基因打靶載體，然后再分別進(jìn)行酶切、連接和轉(zhuǎn)化篩選，這種方法工作周期相對長，至少3次酶切、連接和轉(zhuǎn)化反應(yīng)；一種是通過合理借助Rac噬菌體的RecE/RecT或λ噬菌體Red操縱子（Redα/Redβ/Redγ）系統(tǒng)來介導(dǎo)實(shí)施同源重組反應(yīng)，將從BAC載體中克隆出的同源重組基因（同源序列不必很長，50 bp即可）再次重組和改造進(jìn)而獲得打靶載體。因其所需同源臂短，重組效率高而被廣泛應(yīng)用［12，13］。本實(shí)驗(yàn)中，我們2次利用Red/ET重組體系，一個(gè)是依托質(zhì)粒pSC101-BAD-γβα-A-tet的重組系統(tǒng)，通過轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到含有BAC的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)DNA套取，避免了對BAC等DNA大分子的轉(zhuǎn)移操作，提高轉(zhuǎn)化效率，缺點(diǎn)是不除外最終所得修飾后的DNA中混有pSC101-BAD-γβα-A-tet。另一個(gè)是整合了重組蛋白基因的菌株EL-350，與pSC101-BAD-γβα-A-tet重組系統(tǒng)相似的是都可實(shí)現(xiàn)不再依賴限制性內(nèi)切酶、連接酶的DNA重組，為構(gòu)建打靶載體提供了新的選擇。EL-350使用相對簡單，不僅可反復(fù)轉(zhuǎn)化，重組效率高，并且避開了重組質(zhì)粒對受體質(zhì)粒的影響。我們在構(gòu)建Shbg基因打靶載體的過程中，合理結(jié)合兩系統(tǒng)，使打靶載體的效率獲得提高。

通過以上步驟，2次利用Red-Cre重組酶系統(tǒng)成功構(gòu)建Shbg的條件性敲除載體，為后續(xù)的制作基因敲除小鼠，進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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Construction ofTargeting Vector for ConditionalKnockoutofMurine Shbg

WANGYue1，JINZhen1，SUNLei1，ZHENG Jin-Hua2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Shanghai Research Center for Biomodel Organism，Shanghai201203，China）

Objective To construct the targeting vector for conditional gene knockout of sex hormone-binding globulin（Shbg）in mice.MethodsBased on Red/ET，two LoxP were inserted into both sides of extron 4 and extron 7 for conditional gene knockout of murine Shbg.Firstly，the Shbg gene and its upstream，downstream genes obtained from BAC DNAby PCRwere cloned into plasmid pBR322-MK，which was named pBR322-MKAB.The retrieve plasmid（pBR322-Shbg-Re）was obtained by homologous recombination between the plasmid and BAC.Then a great quantity of Neo fragments obtained from PL452 and PL451 were inserted into the targeting vector after another round of Red/ET and then the final targeting vector（pBR322-MK-SHBG-cko）was achieved.ResultsThe correctstructures ofthe targeting vectorssuch as pBR322-MK-AB，pBR322-Shbg-Re，SHBG-Ln and pBR322-MK-Shbg-cko were confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing analysis.ConclusionThe targeting vector for conditional knockout of murine SHBG was successfully constructed.The construction of targeting vector paved the way for conditional knockout mouse strain generated by targeted mutation of Shbg.

sex hormone-binding globulin；conditional knockout；vector；Red/ET recombination

Q782；R394-33；R394.2

A

0258-4646（2015）03-0203-06

國家自然科學(xué)基金（81170591；81300511）；沈陽市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（F11-262-9-46）

王越（1990-），女，碩士研究生.

金鎮(zhèn)，E-mail：jinzhen66@yahoo.com.cn

2014-09-11

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