（沈陽醫(yī)學(xué)院1.病理生理教研室；2.生理教研室；3.2012級醫(yī)學(xué)影像專業(yè)，沈陽 110034）

胃癌細(xì)胞中BNIP3基因CpG島甲基化及其調(diào)控作用

沈薇1，劉坤2，隋璐1，鄒丹1，胡金瑤3

（沈陽醫(yī)學(xué)院1.病理生理教研室；2.生理教研室；3.2012級醫(yī)學(xué)影像專業(yè)，沈陽 110034）

目的觀察胃癌細(xì)胞株MKN1中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，探討DNA甲基化調(diào)控BNIP3表達(dá)的機(jī)制。方法應(yīng)用亞硫酸氫鹽修飾后克隆測序法檢測MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，應(yīng)用甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）處理MKN1細(xì)胞，觀察給藥前后BNIP3mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的改變。應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測BNIP3基因與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）的結(jié)合。結(jié)果MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)。應(yīng)用5-Aza-CdR處理細(xì)胞后，藥物處理組（5-Aza-CdR濃度為10 μmol/L）和對照組甲基化率和BNIP3mRNA表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5-Aza-CdR抑制MKN1細(xì)胞中DNMT1與BNIP3基因的結(jié)合。結(jié)論MKN1細(xì)胞中BNIP3基因表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化調(diào)控，DNA甲基化的發(fā)生與DNMT1和BNIP3基因結(jié)合有關(guān)。

BNIP3基因；DNA甲基化；胃腫瘤；5-氮雜-2′-脫氧胞苷

胃癌是惡性程度較高的消化道腫瘤，其發(fā)生發(fā)展常涉及多個(gè)抑癌基因的異常表達(dá)。在胃癌癌變早期，抑癌基因的表觀遺傳學(xué)改變占有重要地位，尤其是抑癌基因啟動(dòng)子的異常甲基化［1，2］。Bcl-2腺病毒E1B 19 kDa相關(guān)蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 3，BNIP3）屬于缺氧誘導(dǎo)的線粒體促凋亡蛋白，在胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種消化道腫瘤中檢測到BNIP3表達(dá)缺失［3～6］。甲基化酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）可以恢復(fù)BNIP3表達(dá)缺失的胃癌、結(jié)腸癌細(xì)胞中BNIP3 mRNA的表達(dá)水平［3，6］。但胃癌細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的具體位點(diǎn)及DNA甲基化調(diào)控BNIP3表達(dá)的機(jī)制尚不完全清楚。亞硫酸氫鹽修飾后克隆測序法（bisulfate sequencing polymerase chain reaction，BSP）為一種基于亞硫酸氫鹽修飾的甲基化定量研究方法，可以對基因啟動(dòng)子區(qū)數(shù)十乃至數(shù)百個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行精確量化［7］。本研究擬通過BSP法檢測胃癌細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)，采用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecitation，ChIP）檢測BNIP3基因與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）的結(jié)合情況，分析BNIP3基因表達(dá)水平與啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的相關(guān)性，從表觀遺傳學(xué)角度對BNIP3基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞系MKN1細(xì)胞來源于中國醫(yī)科大學(xué)遺傳學(xué)教研室，5-Aza-CdR購自美國Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，DNA提取試劑盒（Blood＆Cell Culture DNA Mini Kit）購自美國Qiagen公司，亞硫酸氫鹽修飾試劑盒（EZ DNA Methylation-Gold Kit）購自美國Zymo Research公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGEM-T載體、T4 DNA連接酶、GoTaq Master Mix、感受態(tài)細(xì)胞JM109、RNA提取試劑盒（AxyPrep Total RNA Miniprep Kit）、逆轉(zhuǎn)錄酶均購自美國Promega公司，DNMT1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，染色質(zhì)免疫沉淀試劑盒購自美國Active Motif公司，引物合成及測序由上海Life Technologies公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理：MKN1細(xì)胞株用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)、傳代。實(shí)驗(yàn)用對數(shù)生長期細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)至60%匯合度時(shí)，分別加入2 μmol/L或10 μmol/L的5-Aza-CdR處理液，對照組使用不含5-Aza-CdR的普通完全培養(yǎng)液。每隔24 h換液1次，培養(yǎng)72 h后處理細(xì)胞用于后續(xù)的相關(guān)檢測。

1.2.2 亞硫酸氫鹽修飾DNA和BSP反應(yīng)：采用Blood＆Cell Culture DNA Mini Kit試劑盒，按說明書步驟提取各組細(xì)胞基因組DNA。取500 ng DNA按照試劑盒說明進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾及純化。使未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不變。以修飾后基因組DNA為模板，用GoT-aq DNA聚合酶進(jìn)行BNIP3基因啟動(dòng)子擴(kuò)增。用MethPrimer軟件設(shè)計(jì)甲基化引物，上游：5′-TTAAAG TGTTGAGATGAAAGATATG-3′，下游：5′-AATCCA AATCCAAATATCAAAATAC-3′，產(chǎn)物長度為288 bp。反應(yīng)條件為95℃10 min，95℃30 s、56℃30 s、72℃ 30 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用膠回收試劑盒回收，純化目的片段，連接pGEM-T載體，4℃孵育過夜。取6 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)大腸桿菌，藍(lán)白篩選陽性克隆，送菌液測序。

1.2.3 RT-PCR檢測BNIP3基因表達(dá)：采用Axy-Prep Total RNA Miniprep Kit試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，BNIP3引物序列：上游：5′-CCACCTCGCTCGCAGACACCAC-3′，下游：5′-GAGAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC-3′，長度為317 bp。作為內(nèi)參的人β-actin引物序列：上游：5′-CCAGATCATGTTTGAGACCT-3′；下游：5′-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3′，長度為480 bp。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃5 min變性，95℃復(fù)性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃暫時(shí)保存。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-2500R）拍照及分析表達(dá)情況。

1.2.4 染色質(zhì)免疫沉淀：采用ChIP試劑盒按說明書進(jìn)行如下操作：用1%甲醛PBS交聯(lián)固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，加入交聯(lián)終止液5 min，2 500 r/min、4℃離心10 min，PBS洗脫2次；加裂解液冰上裂解5 min，酶法消化切割至200～1 000 bp的染色質(zhì)小片段；之后，染色質(zhì)與DNMT1特異性抗體及DNA/Protein G Agorose 4℃顛轉(zhuǎn)過夜，洗脫蛋白/DNA復(fù)合物，純化回收DNA。針對BNIP3啟動(dòng)子區(qū)的引物序列：上游：5′-CCGCGCCGCCTCCTCCGCCTCAC-3′；下游：5′-GCTCCGACCTCCGCTTTCCCACCGCC-3′。PCR擴(kuò)增條件：95℃5 min，95℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，72℃10 min，30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-2500R）拍照及分析表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，甲基化率比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)

2.1.1 BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島序列分析：在ENSEMBLE上找到BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的原始序列，利用MethPrimer分析，按照“長度超過200 bp，GC含量大于50%，CpG出現(xiàn)率（觀察值／預(yù)測值比例）≥0.6”的參數(shù)定義［8］，可以找到BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)自轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游966 bp至下游86 bp之間長度為1 052 bp的CpG島。圖1為BSP法擬分析其中長288 bp、含14個(gè)CpG位點(diǎn)的DNA片段。

圖1 BNIP3基因Cp G島分析Fig.1 Profile of CpG island within BNIP3gene promoter

2.1.2 BSP結(jié)果：以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA為模板行PCR，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體，轉(zhuǎn)化增菌，PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆。圖2為隨機(jī)挑取的5個(gè)克隆的菌液PCR鑒定結(jié)果，在約288 bp處可見理想的目的條帶。

2.1.3 測序結(jié)果分析：陽性克隆進(jìn)一步測序，將亞硫酸氫鹽修飾后的序列與原序列進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)非CpG位點(diǎn)的“C”全部轉(zhuǎn)化為“T”，證明亞硫酸氫鹽修飾效果可信。擴(kuò)增的BNIP3啟動(dòng)子區(qū)片段包含有14個(gè)CpG位點(diǎn)，與原始BNIP3基因序列比對，各CpG位點(diǎn)甲基化概率分別為100%、80%、100%、100%、 80%、100%、100%、100%、80%、100%、100%、80%、100%、100%。見圖3及圖4。

圖2 BSP后目的DNA連T載體挑選陽性克隆電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of positive recombinants for target DNA with T carrier in MKN1 cells after BSP

圖3 BSP部分測序結(jié)果Fig.3 Part of bisulfate sequencing results of BSP for MKN1 cells

2.2 5-Aza-CdR對MKN1細(xì)胞中BNIP3表達(dá)的影響

采用不同濃度5-Aza-CdR處理MKN1細(xì)胞，作用72 h后，對照組、2 μmol/L 5-Aza-CdR處理組和10 μmol/L 5-Aza-CdR組的BNIP3mRNA相對表達(dá)量分別為0.389±0.018，0.515±0.024，0.839±0.014。10 μmol/L 5-Aza-CdR組的BNIP3mRNA表達(dá)量較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

2.3 5-Aza-CdR對MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子甲基化的影響

圖4 BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)14個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)Fig.4 Mehylation status of 14 CpG sites in BNIP3promoter

圖5 5-Aza-CdR藥物處理前后BNIP3mRNA表達(dá)Fig.5 Effect of 5-Aza-CdR on BNIP3 mRNA expression in MKN1 cells

10 μmol/L的5-Aza-CdR處理細(xì)胞72 h后，BNIP3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)有所逆轉(zhuǎn)（圖6），啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化率（74.2%±9.37%）與對照組（圖4）甲基化率（94.3%±19.80%）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 5-Aza-CdR處理后BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)Fig.6 Methylation analysis of CpG site in BNIP3 promoter after 5-Aza-CdR treatment

2.4 BNIP3啟動(dòng)子與DNMT1蛋白的結(jié)合

用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測MKN1細(xì)胞中DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合。結(jié)果顯示，在對照組可以檢測到DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合，而10 μmol/L的5-Aza-CdR處理組與對照組相比DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合明顯減少。見圖7。

3 討論

圖7 5-Aza-CdR對DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子結(jié)合的影響Fig.7 Binding ability of DNMT1 to the promoter of BNIP3after 5-Aza-CdR treatment by ChIP

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的重要作用方式之一，指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。越來越多的研究表明，DNA甲基化在癌癥的發(fā)生機(jī)制中扮演重要角色。正常生理?xiàng)l件下，人類基因組中位于啟動(dòng)子區(qū)、富含CpG二核苷酸的CpG島處于非甲基化狀態(tài)，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島過度甲基化可誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄失活、表達(dá)沉默［1，2］。BNIP3是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，具有BH3結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)，屬于促凋亡蛋白，通過促進(jìn)線粒體通透性、轉(zhuǎn)運(yùn)開放和線粒體的損傷誘導(dǎo)凋亡。Murai等［3］在66%的結(jié)直腸癌和49%的胃癌中檢測到BNIP3表達(dá)缺失。Abe等［4］發(fā)現(xiàn)在幾乎所有的胰腺癌組織和50%的胰腺癌細(xì)胞系中未檢測到BNIP3的表達(dá)，其失活機(jī)制和DNA啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化相關(guān)。

目前，國內(nèi)關(guān)于BNIP3基因的甲基化研究基本都局限于甲基化特異PCR法［9，10］，此方法的特點(diǎn)是靈敏度高，但只能對引物序列中少量CpG位點(diǎn)進(jìn)行分析，具有一定的局限性。所以關(guān)于腫瘤細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的具體位點(diǎn)還不清楚。BSP克隆測序法具有能明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)的優(yōu)勢，是公認(rèn)的DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)［7］。本研究利用MethPrimer軟件分析了MKN1細(xì)胞中BNIP3基因CpG位點(diǎn)分布情況。結(jié)果顯示，BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)自轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游966 bp至下游86 bp之間CpG位點(diǎn)分布密集，存在長度為1 052 bp的CpG島。本研究中利用BSP克隆測序法對BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)中（+21 bp～-267 bp）長288 bp、包含14個(gè)CpG位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行甲基化水平的檢測，甲基化率為80%～100%。因此，首次明確了胃癌MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化位點(diǎn)，并檢測到這些CpG位點(diǎn)呈現(xiàn)高度的甲基化。

我們進(jìn)一步用去甲基化藥物處理MKN1細(xì)胞，以明確啟動(dòng)子甲基化與BNIP3基因表達(dá)的關(guān)系。5-Aza-CdR是一種高效的DNMT抑制劑，它可與DNMT不可逆性結(jié)合，具有較強(qiáng)去甲基化作用，使表觀遺傳學(xué)沉默的基因去甲基化，逆轉(zhuǎn)其惡性表型［9，11］。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組MKN1細(xì)胞中BNIP3表達(dá)缺失，10 μmol/L的5-Aza-CdR可誘導(dǎo)BNIP3mRNA表達(dá)明顯增加，BNIP3基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化概率較對照組明顯下降，提示胃癌MKN1細(xì)胞中BNIP3基因表達(dá)缺失與啟動(dòng)子區(qū)高甲基化關(guān)系密切，該區(qū)域的CpG位點(diǎn)甲基化在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。

DNA甲基化是由DNMT催化完成的。DNMT1催化甲基基團(tuán)與胞嘧啶環(huán)的結(jié)合，維持DNA復(fù)制過程中的甲基化模式，在表觀遺傳修飾中發(fā)揮重要作用，其活性及表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。近年研究報(bào)道，DNMT1通過與靶基因啟動(dòng)子DNA序列結(jié)合，介導(dǎo)DNA甲基化，調(diào)節(jié)基因表達(dá)［12，13］。我們推測DNMT1是否參與介導(dǎo)BNIP3發(fā)生DNA甲基化的機(jī)制。我們利用ChIP技術(shù)檢測DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合狀態(tài)。結(jié)果顯示，MKN1細(xì)胞中DNMT1能與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合。5-Aza-CdR能夠明顯抑制DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子的結(jié)合。提示5-Aza-CdR降低DNMT1與BNIP3啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合能力，部分逆轉(zhuǎn)BNIP3的甲基化狀態(tài)，是導(dǎo)致MKN1細(xì)胞中BNIP3表達(dá)上調(diào)的重要原因。

綜上所述，本研究首次明確了胃癌MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的具體位點(diǎn)，證實(shí)了MKN1細(xì)胞中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)存在高甲基化，BNIP3基因表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化調(diào)控，甲基化的發(fā)生與DNMT1和BNIP3基因啟動(dòng)子結(jié)合有關(guān)。揭示了BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化的機(jī)制，有助于從表觀遺傳學(xué)角度揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。

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（編輯陳姜）

CpGIsland Methylation Regulates BNIP3Gene Expression in Gastric Cancer Cells

SHENWei1，LIUKun2，SUILu1，ZOUDan1，HUJin-yao3
（1.DepartmentofPathophysiology，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China；2.DepartmentofPhysiology，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China；3.Grade 2012 MedicalImaging，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China）

Objective To detectthe methylation statusofthe promoterof BNIP3gene in gastric cancercelllines MKN1，and to explore the mechanism of DNA methylation regulating the expression of BNIP3in gastric cancer cells.MethodsThe methylation status of BNIP3promoter was detected by bisulfate sequencing PCR.Reverse transcription PCR was used to evaluate BNIP3mRNAexpression.MKN1 cells were treated with 5-Aza-2′-deoxycytidine（5-Aza-CdR），and after the treatment，the methylation status and BNIP3mRNA expression were observed.Chromatin immunoprecipitation（ChIP）was used to determine the combination of BNIP3 with DNA methyltransferase 1（DNMT1）.ResultsThe promoter DNA of BNIP3in MKN1 cells was in state of hypermethylation.Compared to the control group，methylation status and mRNA expression of BNIP3in the drug treatment group（the 5-Aza-CdR concentration was 10 μmol/L）were reversed，which showed statistical differences（P＜0.05）.5-Aza-CdR inhibited the combination of BNIP3 with DNMT1.ConclusionCpG island methylation regulates BNIP3 gene expression in MKN1 cells.DNA methylation is related with the binding between the promoterof BNIP3and DNMT1.

BNIP3gene；DNA methylation；stomach neoplasms；5-Aza-2′-deoxycytidine

R735.2

A

0258-4646（2015）03-0221-05

遼寧省教育廳杰出青年學(xué)者成長計(jì)劃（LJQ2012091）；沈

陽醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀人才啟動(dòng)基金（20123041）

沈薇（1976-），女，副教授，博士.

E-mail：shenwei1119@163.com

2014-12-15

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：