秦宇，趙江月，羅文婷2，李晶，吳欣蔚，劉佳，閻啟昌，張勁松

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110005；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，沈陽(yáng) 110004）

Eaf2基因調(diào)控microRNA抑制白內(nèi)障發(fā)生的機(jī)制研究

秦宇1，趙江月1，羅文婷2，李晶1，吳欣蔚1，劉佳1，閻啟昌1，張勁松1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110005；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，沈陽(yáng) 110004）

目的探討Eaf2基因敲除小鼠中microRNA的表達(dá)情況，以及Eaf2基因?qū)θ司铙w上皮細(xì)胞凋亡及晶狀體內(nèi)microRNA表達(dá)的影響。方法利用Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒過(guò)表達(dá)Eaf2基因，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化，利用Real time q-PCR方法檢測(cè)人晶狀體上皮細(xì)胞中microRNA的表達(dá)情況；利用Real time q-PCR方法檢測(cè)Eaf2基因敲除小鼠microRNA的表達(dá)情況。結(jié)果pEGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組，miR-125b、let-7a的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，而miR-204的表達(dá)顯著低于對(duì)照組；Eaf2基因敲除小鼠miR-125b、let-7a的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，而miR-204的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論Eaf2基因可能通過(guò)調(diào)控microRNA的表達(dá)抑制人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，從而在白內(nèi)障發(fā)生中發(fā)揮晶狀體保護(hù)作用。

Eaf2；microRNA；基因調(diào)控；白內(nèi)障

11-19賴氨酸富集白血?。╡leven-nineteen lysine -rich leukemia，ELL）基因相關(guān)因子2（ELL-associated factor 2，Eaf2）是一種富含賴氨酸的RNA聚合酶Ⅱ的延伸因子，位于3號(hào)染色體長(zhǎng)臂3q13.33，編碼由260個(gè)氨基酸組成的蛋白，可以通過(guò)與ELL家族蛋白作用正性調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)。近年來(lái)，有關(guān)Eaf2基因功能的研究多集中在其抑癌作用的分子機(jī)制領(lǐng)域［1］。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)Eaf2基因在眼部的功能了解甚少。研究發(fā)現(xiàn)，Eaf2基因參與紫外線照射引起的DNA損傷修復(fù)活動(dòng)［2］，而紫外線是年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生的最重要的危險(xiǎn)因素［3］，提示Eaf2蛋白可能作為保護(hù)因子參與晶狀體細(xì)胞的代謝和損傷修復(fù)，從而防止或延緩白內(nèi)障的發(fā)生。而晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是除先天性白內(nèi)障以外其他類型白內(nèi)障發(fā)生的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［4］，推測(cè)Eaf2可能參與調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是近年發(fā)現(xiàn)的一種小分子非編碼RNA，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)RNA半衰期或者與3′UTR區(qū)結(jié)合抑制靶基因翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平影響發(fā)育、增殖、分化、凋亡等過(guò)程中組織特異性基因的表達(dá)［5～7］。microRNA作為轉(zhuǎn)錄因子重要的靶分子在細(xì)胞功能調(diào)控中發(fā)揮核心作用。已有研究證實(shí)，microRNA與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［8～10］。因此，推測(cè)Eaf2基因可能通過(guò)調(diào)控microRNA的表達(dá)影響晶狀體細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程，最終作為保護(hù)因子，干預(yù)或延緩白內(nèi)障的發(fā)生。

前期研究證實(shí)，miR-125b通過(guò)直接抑制靶基因p53的表達(dá)調(diào)控人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡［11］。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件TargetScan 5.2，Diana-micro T和miRanda共同預(yù)測(cè)得出，miR-204可能靶向調(diào)控B淋巴細(xì)胞瘤/白血病2（bcl-2）基因，let-7a可能靶向調(diào)控天冬氨酸特異性的半胱氨酸酶3（caspase-3）基因，而bcl-2基因和caspase-3基因在線粒體通路這一最主要的凋亡通路中發(fā)揮重要作用，提示miR-204、let-7a可能與凋亡密切相關(guān)。因此，本研究選擇了miR-125b、miR-204和let-7a這3種microRNA作為研究對(duì)象。

本研究利用Eaf2基因敲除小鼠及pEGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)染、流式細(xì)胞技術(shù)、Real time q-PCR等方法，進(jìn)行了離體及在體實(shí)驗(yàn)，探討Eaf2基因敲除小鼠中microRNA的表達(dá)情況，以及Eaf2基因?qū)θ司铙w上皮細(xì)胞凋亡的影響及晶狀體內(nèi)microRNA的調(diào)控作用，進(jìn)一步探討Eaf2基因在白內(nèi)障發(fā)生中是否具有晶狀體保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人晶狀體上皮細(xì)胞系（SRA01/04）由美國(guó)Doheny眼科研究所Dr.Yi-sin Liu惠贈(zèng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Eaf2基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠由美國(guó)Doheny眼科研究所Dr.Yi-sin Liu惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：SRA01/04細(xì)胞利用DMEM培養(yǎng)基（含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。將SRA01/04細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國(guó)）將pEGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒和pEGFP-C1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SRA01/04細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：利用細(xì)胞凋亡PI染色試劑盒（KenGEN公司，中國(guó)），用1×Buffer A洗滌細(xì)胞1次（離心2 000 r/min，5 min），收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL；細(xì)胞加9倍體積的70%乙醇，于-20℃固定至少12 h；離心收集細(xì)胞后，用1×Buffer A洗細(xì)胞除去乙醇，細(xì)胞重懸于500 μL Buffer A中；加入RNase A，使其終濃度為0.25 mg/mL，37℃反應(yīng)30 min；加入5 μL PI，室溫避光染色30 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本制備：將Eaf2基因敲除小鼠（Eaf2-/-）和C57BL/6小鼠交配，子代小鼠留取鼠尾提取DNA，PCR鑒定基因型。選取Eaf2雜合子小鼠（Eaf2+/-）相互交配，子代小鼠留取鼠尾提取DNA，PCR鑒定基因型。選取基因型為Eaf2-/-的小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，同窩基因型為Eaf2+/+的小鼠作為對(duì)照組。乙醚麻醉小鼠，斷頸處死，顯微鏡下解剖，取眼球晶狀體，DEPC-PBS沖洗1～2次，備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.4 Real time q-PCR檢測(cè)microRNA的表達(dá)：利用Trizol?Reagent（Invitrogen公司，美國(guó)）提取總RNA，PrimerScriptTMRT Enzyme Mix（Takara公司，日本）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用SYBR Premix Ex TaqⅡ（Takara公司，日本）檢測(cè)microRNA的表達(dá)量，RNU6B為內(nèi)參對(duì)照。miR-125b、miR-204和let-7a的RT引物、特異性上游引物和通用下游引物由Ribobio公司合成。利用ABI 7500（Applied Biosystems公司，美國(guó)）進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)，利用公式RQ=2-ΔΔCt進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Eaf2基因抑制人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡

向SRA01/04細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒和pEGFP-C1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48 h，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果顯示：pEGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。提示Eaf2基因可能抑制人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。

圖1 Eaf2基因?qū)θ司铙w上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控Fig.1 The effect of Eaf2on apoptosis of human lens epithelial cells

2.2 Eaf2基因調(diào)控晶狀體內(nèi)microRNA的表達(dá)

向SRA01/04細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒和pEGFP-C1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48 h，利用Real time q-PCR方法檢測(cè)microRNA的表達(dá)情況，RNU6B作為內(nèi)參對(duì)照。結(jié)果顯示：pEGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組miR-125b、let-7a的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），而miR-204的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 Eaf2基因?qū)铙w內(nèi)microRNA表達(dá)的調(diào)控Fig.2 The effect of Eaf2on the expression of microRNA in lens

2.3 Eaf2基因敲除小鼠microRNA的表達(dá)

利用Real time q-PCR方法，檢測(cè)基因型為Eaf2-/-的小鼠和同窩基因型為Eaf2+/+的小鼠microRNA的表達(dá)情況，RNU6B作為內(nèi)參對(duì)照。結(jié)果顯示：Eaf2-/-組miR-125b、let-7a的表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），而miR-204的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

3 討論

圖3 Eaf2基因敲除小鼠microRNA的表達(dá)Fig.3 The expression of microRNA in Eaf2 knockout mice

Eaf2基因最早因其調(diào)控胚胎發(fā)育及在前列腺中對(duì)雄激素的應(yīng)答而被發(fā)現(xiàn)。有關(guān)Eaf2基因功能的研究，國(guó)內(nèi)外學(xué)者多集中在其抑癌作用的分子機(jī)制領(lǐng)域，例如，在前列腺癌發(fā)病分子機(jī)制領(lǐng)域及對(duì)胚胎發(fā)育的影響等方面［1］。Eaf2作為ELL因子的結(jié)合蛋白發(fā)揮抑癌作用，同時(shí)ELL與p53也可以結(jié)合。Su等［12］在肝癌和前列腺癌組織中發(fā)現(xiàn)Eaf2與p53結(jié)合后可以調(diào)控血小板凝血酶致敏蛋白1（thrombospondin-1，TSP-1）啟動(dòng)子的活性，從而抑制腫瘤血管的生成，證實(shí)了Eaf2與p53之間的伴侶和調(diào)控關(guān)系。而p53具有誘導(dǎo)microRNA轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)特異的microRNA成熟，通過(guò)調(diào)控microRNA影響細(xì)胞增殖、分化等的功能［13］。p53在晶狀體內(nèi)大量表達(dá)，且表達(dá)位置與Eaf2一致［14］。提示Eaf2可能參與對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

然而，目前有關(guān)Eaf2基因在眼部的功能方面的研究較少。研究證實(shí)，Eaf2基因在發(fā)育中的晶狀體赤道部上皮細(xì)胞、分化的晶狀體纖維細(xì)胞及神經(jīng)視網(wǎng)膜中大量表達(dá)，對(duì)眼球發(fā)育起重要的調(diào)節(jié)作用［15］。另有研究發(fā)現(xiàn)，Eaf2基因參與紫外線照射引起的DNA損傷修復(fù)活動(dòng)［2］，而紫外線是年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生的最重要的危險(xiǎn)因素［3］，紫外線照射后可以損傷晶狀體上皮細(xì)胞間縫隙連接蛋白（Cx），影響細(xì)胞間信息傳遞，是白內(nèi)障發(fā)生的機(jī)制之一［16］，人類或者動(dòng)物受到紫外線急性輻射損傷或低劑量照射累積均可以導(dǎo)致白內(nèi)障［17］。因而我們推測(cè)Eaf2基因在白內(nèi)障的發(fā)生中可能發(fā)揮一定的作用。

microRNA是長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的一類單鏈內(nèi)源性小分子非編碼RNA［18］，在不同組織中表達(dá)具有特異性，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶基因進(jìn)行負(fù)向調(diào)控。單個(gè)microRNA可以作用于多個(gè)靶基因，而多個(gè)microRNA可以作用于同一靶基因，由此形成了microRNA復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。人類整個(gè)基因組中，約1/3的編碼蛋白基因受其調(diào)控［19］。microRNA的出現(xiàn)改變了以往對(duì)非編碼RNA的認(rèn)知。microRNA參與生命過(guò)程中包括發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡等一系列重要的活動(dòng)［8～11］，它與疾病的關(guān)系日益引起人們關(guān)注。研究證實(shí)，microRNA與多種疾病，包括眼部疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切的聯(lián)系［20～22］。隨著新的生物信息學(xué)方法和技術(shù)的產(chǎn)生，microRNA成為基因診斷和治療的新熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：向SRA01/04細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-Eaf2質(zhì)粒，使Eaf2基因過(guò)表達(dá)，細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示Eaf2基因可能抑制人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。Eaf2基因過(guò)表達(dá)使miR-125b、let-7a的表達(dá)顯著升高，miR-204的表達(dá)顯著降低。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Eaf2基因敲除小鼠miR-125b、let-7a的表達(dá)顯著降低，miR-204的表達(dá)顯著升高。

綜上所述，強(qiáng)烈提示Eaf2這種轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)調(diào)控microRNA的表達(dá)影響晶狀體細(xì)胞凋亡，作為保護(hù)因子干預(yù)或防止白內(nèi)障的發(fā)生。Eaf2基因很有可能是影響白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)鍵基因，明確其在晶狀體內(nèi)的調(diào)控功能可能會(huì)從分子水平揭示白內(nèi)障發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，值得進(jìn)一步深入研究。

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（編輯王又冬）

Mechanism of Eaf2Gene Regulating microRNA in Inhibiting the GenesisofCataract

QINYu1，ZHAOJiang-yue1，LUOWen-ting2，LIJing1，WUXin-wei1，LIUJia1，YANQi-chang1，ZHANGJin-song1
（1.Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Eye Hospital of China Medical University，Key Lens Research Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110005，China；2.Key Laboratory of Health Ministry for Congenital Malformation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the expression ofmicroRNAin Eaf2knockoutmice and the effectof Eaf2on the apoptosis ofhuman lens epithelial cells and the expression of microRNA in lens.MethodspEGFP-C1-Eaf2 was transfected into SRA01/04 cells using Lipofectamine 2000 to over express Eaf2gene，and then the flow cytometry was used to detect cell apoptosis rate.And real time q-PCR was used to measure the expression of microRNA both in human lens epithelial cells and Eaf2 knockout mice.ResultsCompared with controls，the apoptosis rate of cells transfected with pEGFP-C1-Eaf2 was reduced，the expression ofmiR-125b and let-7a wassignificantly increased and miR-204 wasdecreased in cells transfected with pEGFP-C1-Eaf2.Compared with controls，the expression of miR-125b and let-7a was lower and miR-204 was higher in Eaf2knockout mice.Each result was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionEaf2might inhibit apoptosis of human lens epithelial cells via regulating the expression ofmicroRNA.Eaf2 may have a protective effectforthe lensin the genesisofcataract.

Eaf2；microRNA；gene regulation；cataract

R776.1

A

0258-4646（2015）03-0199-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81270988）；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究一般項(xiàng)目（L2014305）；中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院青年創(chuàng)新發(fā)展基金項(xiàng)目（YB1217）

秦宇（1982-），女，講師，博士.

張勁松，E-mail：zhangjs0331@126.com

2014-12-23

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：