（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110004；2.沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110031）

Notch基因胞內(nèi)活化部分真核表達(dá)載體p3XFLAG-CMV7-NICD1的構(gòu)建與鑒定

劉蕾1，2，肖偉1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110004；2.沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110031）

目的構(gòu)建Notch1基因胞內(nèi)活化部分真核表達(dá)載體p3XFLAG-CMV7-NICD1，為進(jìn)一步研究和解析Notch1基因在促進(jìn)人晶狀體上皮細(xì)胞間質(zhì)化過(guò)程的作用做準(zhǔn)備。方法從SRA01/04細(xì)胞中提取總RNA，RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。特異擴(kuò)增目的基因片段NICD1，與p3XFLAG-CMV7載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，LB平板培養(yǎng)基篩選菌落，抽提質(zhì)粒。并用酶切，測(cè)序，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè)蛋白表達(dá)等方法驗(yàn)證。結(jié)果獲得重組的p3XFLAG-CMV7-NICD1真核表達(dá)載體質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測(cè)序檢測(cè)，NICD1基因插入載體部位正確，堿基序列正確。Western blot結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染p3XFLAG-CMV7-NICD1的細(xì)胞中有NICD1蛋白的表達(dá)。結(jié)論p3XFLAG-CMV7-NICD1真核表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究Notch1傳導(dǎo)通路與白內(nèi)障摘除術(shù)后發(fā)生后囊膜混濁的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

Notch1信號(hào)通路；NICD1；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；后囊膜混濁

晶體后囊膜混濁（posterior capsular opacification，PCO）是白內(nèi)障摘除術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，常常導(dǎo)致術(shù)后視力下降。前囊膜上殘留的細(xì)胞遷移到后囊膜并進(jìn)行上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是后囊膜混濁發(fā)生的關(guān)鍵。有研究表明Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路且能夠促進(jìn)上皮間質(zhì)纖維化。當(dāng)Notch1配體與相鄰細(xì)胞的受體結(jié)合后即觸發(fā)Notch1信號(hào)活化，NICD1即為Notch1蛋白的活化形式［1］。本課題從SRA01/04細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得Notch1基因胞內(nèi)段基因片段（NICD1）構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1，為進(jìn)一步研究Notch1傳導(dǎo)通路與白內(nèi)障摘除術(shù)后發(fā)生后囊膜混濁的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞

真核表達(dá)載體p3XFLAG-CMV-7（購(gòu)自Sigma公司），SRA01/04細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存）及感受態(tài)細(xì)胞E.coli Competent cells DH5α（購(gòu)自Takara公司）。

1.2 試劑

RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒，普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（購(gòu)自TIANGEN公司）。Taq DNA Polymerase，dNTPs脫氧核苷酸（購(gòu)自Takara公司）。質(zhì)粒DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒（購(gòu)自AXYGEN公司）。DNA T4連接酶、XbaI/BamHI核酸內(nèi)切酶（購(gòu)自NEB公司）。LipofectamineTMLTX轉(zhuǎn)染試劑（購(gòu)自Invitrogen公司）。兔抗NICD1多克隆抗體（購(gòu)自Cell Signaling Technology公司），兔抗Flag多克隆抗體（購(gòu)自北京博奧森公司）。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

參照文獻(xiàn)［2］，并從GenBank獲取Notch1胞內(nèi)段基因已知序列，根據(jù)末端氨基酸序列分析結(jié)果，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)出可擴(kuò)增NICD1相對(duì)應(yīng)堿基在內(nèi)的引物，并分別在上游及下游引物引入XbaI/Bam-HI酶切位點(diǎn)，上游引物：5C-GCCTCTAGAGTGCTGC TGTCCCGCAAGCGC-3C，下游引物：5C-CGGGATC CTTATTTAAATGCCTCTGGAATGTGGG-3C，引物由TaKaRa公司合成。

1.4 胞內(nèi)段NICD1目的基因擴(kuò)增

按TaKaRa公司試劑盒說(shuō)明書(shū)提取SRA01/04細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以此cDNA為模板，運(yùn)用以上設(shè)計(jì)引物，按照程序行PCR擴(kuò)增：93℃預(yù)變性3 min；93℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。

1.5 p3XFLAG-CMV-7-NICD1重組質(zhì)粒的構(gòu)建

XbaI/BamHI同時(shí)對(duì)目的DNA片段及質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-7進(jìn)行雙酶切（3 h），瓊脂糖凝膠電泳回收目的DNA酶切片段和p3XFLAG-CMV-7載體酶切片段并定量，建立如下連接反應(yīng)體系：p3XFLAG-CMV-7載體1 μL，NICD1插入片段1 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，10×連接緩沖液0.5 μL，加重去離子水2 μL，總反應(yīng)體積5 μL。22℃連接1 h。結(jié)束后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，涂布于37℃預(yù)熱的含氨芐青霉素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振搖培養(yǎng)過(guò)夜。按AXYGEN質(zhì)粒DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒DNA。

1.6 p3XFLAG-CMV-7-NICD1重組質(zhì)粒的鑒定

p3XFLAG-CMV-7-NICD1重組質(zhì)粒的XbaI/ BamHI雙酶切反應(yīng)體系：XbaI，1 μL；BamHI，1 μL； 10xNEB Buffer，3 μL，p3XFLAG-CMV-7-NICD1，5 μL；100×BSA，0.3 μL；ddH2O，20.7 μL。37℃3 h。質(zhì)粒測(cè)序由Takara公司完成。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及Western blot檢測(cè)

按照LipofectamineTMLTX說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)組p3XFLAG-CMV-7-NICD1，空載體p3XFLAGCMV-7為對(duì)照組分別用LipofectamineTMLTX試劑轉(zhuǎn)染入SRA01/04細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染4 h后換液，24 h后進(jìn)行Western blot檢測(cè)。采用RIPA蛋白提取液制備細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白質(zhì)定量后取40 μg總蛋白進(jìn)行Immunoblotting檢測(cè)帶Flag標(biāo)簽的NICD1的表達(dá)。以兔抗Flag多克隆抗體（1∶1 000）為一抗，辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶3 000）為二抗，抗體反應(yīng)結(jié)束后加入Pierce公司的增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 NICD1基因片段和真核表達(dá)載體p3XFLAGCMV-7的制備

真核表達(dá)載體p3XFLAG-CMV-7和RT-PCR擴(kuò)增后的NICD1基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1），分別可見(jiàn)約4 700 bp和2 361 bp的特異條帶，條帶分子大小與預(yù)計(jì)相同。

圖1 p3XFLAG-CMV-7和NICD1片段電泳結(jié)果Fig.1 RT-PCR products of p3XFLAG-CMV-7 and NICD1

2.2 酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1

重組質(zhì)粒用XbaI/BamHI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳（圖2），可見(jiàn)切下大小約為4 700 bp及2 300 bp的2條條帶，分別為p3XFLAG-CMV-7和NICD1。片段大小與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。表明NICD1基因已成功克隆至真核表達(dá)載體p3XFLAG-CMV-7中。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1測(cè)序分析

圖2 p3XFLAG-CMV-7-NICD1雙酶切結(jié)果Fig.2 Digestion products of p3XFLAG-CMV-7-NICD1 with enzymes

重組質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1送Takara公司進(jìn)行測(cè)序鑒定（圖3），目的片段與GenBank中人Notch1胞內(nèi)段基因的序列進(jìn)行比對(duì)，測(cè)序結(jié)果與GenBank報(bào)道的人Notch1胞內(nèi)段基因序列一致。鑒定結(jié)果表明目的片段已正確插入p3XFLAG-CMV-7表達(dá)載體。

2.4 真核表達(dá)載體p3XFLAG-CMV-7-NICD1在SRA01/04細(xì)胞中的表達(dá)

通過(guò)LipofectamineTMLTX試劑將p3XFLAGCMV-7-NICD1和對(duì)照的空載體分別轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞，24 h后提取總蛋白，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果如圖4顯示，在實(shí)驗(yàn)組中有Flag-NICD1蛋白的表達(dá)，分子量大小約120 kDa，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)。

圖3 p3XFLAG-CMV-7-NICD1真核表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果Fig.3 The gene sequencing results of p3XFLAG-CMV-7-NICD1

圖4 重組蛋白FLAG-NICD1的Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Expression of FLAG-NICD1 protein analyzed by Western blot

3 討論

后發(fā)性白內(nèi)障指白內(nèi)障摘出術(shù)（囊外摘出、單純吸除或超聲乳化白內(nèi)障吸除）后，或外傷性白內(nèi)障部分皮質(zhì)吸收后殘留晶狀體上皮細(xì)胞（lens epkhelial cells，LECs）增生、分化并移行導(dǎo)致的晶狀體后囊膜混濁，簡(jiǎn)稱后發(fā)障。PCO是白內(nèi)障術(shù)后最常見(jiàn)的影響視力的并發(fā)癥［3］。成人白內(nèi)障術(shù)后2年內(nèi)有20%～30%的患者因PCO而視力下降［4］，ECCE術(shù)后5年內(nèi)仍有43%的患者會(huì)發(fā)生PCO［5］。而兒童術(shù)后早期即會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的后發(fā)障，且發(fā)生率高達(dá)100%。

目前研究認(rèn)為，晶狀體上皮細(xì)胞增殖、迀移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、膠原沉積和晶狀體纖維組織形成是PCO的主要原因。白內(nèi)障手術(shù)刺激可能誘導(dǎo)晶狀體發(fā)生創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，殘余的LECs增殖并沿后囊膜遷移，經(jīng)過(guò)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化形成晶狀體纖維組織［6］。與其他組織器官的纖維化機(jī)制有所不同，腎間質(zhì)纖維化和肺纖維化組織中的肌成纖維細(xì)胞可由成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成，而晶狀體組織局部不存在成纖維細(xì)胞，晶狀體纖維化過(guò)程中肌成纖維細(xì)胞只來(lái)源于上皮細(xì)胞，因此，研究EMT在PCO發(fā)生過(guò)程中的作用有重要價(jià)值［7，8］。誘導(dǎo)EMT的主要分子信號(hào)通路有Wnt/p-catenin信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)/ ILK信號(hào)通路和TGFp/Smad信號(hào)通路以及Notch信號(hào)通路。1917年，Morgan及其同事在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種基因，因其功能部分缺失可導(dǎo)致果蠅翅緣出現(xiàn)缺口，故命名該基因?yàn)镹otch［9］。

近來(lái)有研究表明Notch1在晶狀體上皮細(xì)胞中有表達(dá)，而且在正常晶狀體組織及再生晶狀體組織中均檢測(cè)到Notch1表達(dá)［10，11］。Notch1信號(hào)激活后，NICD1是Notch1的活化形式，NICD1進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮傳遞信號(hào)的作用。外源性NICD1編碼基因?qū)氚屑?xì)胞后，其對(duì)靶基因的調(diào)控與Notch1配體所誘導(dǎo)的Notch1信號(hào)途徑激活一致［12，13］。

本研究通過(guò)從SRA01/04細(xì)胞中提取總RNA，RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進(jìn)一步擴(kuò)增獲Notch1胞內(nèi)段基因片段（NICD1），將其克隆于真核表達(dá)載體p3XFLAG-CMV-7，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-7-NICD1，酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期一致；測(cè)序結(jié)果與GenBank報(bào)道的人Notch1胞內(nèi)段基因序列完全一致。Western blot檢測(cè)p3XFLAG-CMV -7-NICD1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有NICD1蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步研究Notch1信號(hào)上調(diào)促進(jìn)EMT和白內(nèi)障摘除術(shù)后發(fā)生后囊膜混濁的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

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（編輯裘孝琦）

Construction and Identification of Recombinant Plasmid ofp3XFLAG-CMV7-NICD1

LIULei1，2，XIAOWei1
（1.DepartmentofOphthalmology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo constructthe eukaryotic expression vectorof Notch1intracellulardomain，p3XFLAG-CMV7-NICD1，so as to prepare for the further research and exploration of effect of Notch1on promoting epithelial-mesenchymal transition of human lens epithelial cells.MethodsThe cDNA fragmentwas reversely transcribed by RT-PCRfrom totalRNA extracted from the SRA01/04 cells and was encoded with the specific amplification-targeted NICD1was obtained from the SRA01/04 cells，then the cDNA fragment was inserted into p3XFLAG-CMV7 to transcribe Escherichia coli DH5α.And the recombinant plasmid was extracted after bacterial screening by LB plating medium and confirmed by the restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.ResultsThe target gene obtained had the same molecular size as predicted.It was indicated that recombined p3XFLAG-CMV7 plasmid contained correct recombinant human Notch1sequences and p3XFLAG-CMV7-NICD1was constructed successfully.The western blotting showed protein NICD1 expressed in SRA01/04 cells transfected with p3XFLAG-CMV7-NICD1.ConclusionThe successful construction of p3XFLAG-CMV7-NICD1will provide a foundation for a further study studies in on the effect relationship of Notch signaling pathway and in posteriorcapsularopacification（PCO）aftercataractextraction.

Notch1 signaling pathway；NICD1；epithlial-mesenchymal transition；posterior capsular opacification

R776.1

A

0258-4646（2015）03-0217-04

劉蕾（1979-），女，主治醫(yī)師，博士研究生.

肖偉，E-mail：xiaow@sj-hospital.org

2014-10-30

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