張 娜

邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校診斷教研室，河北 邢臺(tái)054000

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)存在于機(jī)體多種組織中，可在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增［1］，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前多數(shù)研究主要針對(duì)MSCs對(duì)腫瘤的影響，人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCB-MSCs)在胃癌中的研究卻少有報(bào)道。本文通過分析hUCB-MSC在體外對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，以期對(duì)胃癌的治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 hUCB-MSCs，天津昂賽公司提供;人胃癌細(xì)胞株MGC80-3，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供，且在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并在37 ℃，5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 RPMI-1640、α-DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO 公司生產(chǎn);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，美國(guó)SIGMA 公司生產(chǎn)。

1.3 hUCB-MSCs 原代培養(yǎng)、純化及表型鑒定 在含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 μl/ml 的α-DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)hUCB-MSCs。以5 000/cm2接種，達(dá)90%融合時(shí)胰酶消化傳代。hUCB-MSCs 培養(yǎng)至第4 代，采用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行表型鑒定。

1.4 MGC80-3 細(xì)胞培養(yǎng) 將含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/ml 的RPMI-1640 培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)人胃癌MGC80-3 細(xì)胞。以10 000/cm2接種，達(dá)50%融合時(shí)更換培養(yǎng)基，達(dá)90%融合時(shí)胰酶消化傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)佳，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。收集細(xì)胞后用PBS液洗滌2 次，備用。

1.5 MTT 法測(cè)定細(xì)胞增殖反應(yīng) 取對(duì)數(shù)期人胃癌MGC80-3 細(xì)胞，以每孔1 ×104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中，補(bǔ)足培養(yǎng)液至200 μl，將96 孔板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱，24 h 細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組換用含不同濃度的MSC-CM，每個(gè)濃度做5 個(gè)復(fù)孔，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入0.5% MTT 20 μl，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心棄去孔內(nèi)上清。每孔加入濃度為10%的DMSO 150 μl，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸光度值(OD)，檢測(cè)波長(zhǎng)492 nm，參考波長(zhǎng)620 nm。按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。抑制率(%)= (1 - 實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值)×100%。

1.6 倒置相差顯微鏡觀察hMSC-CMs 對(duì)MGC80-3細(xì)胞形態(tài)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC80-3 細(xì)胞，調(diào)整其濃度為5 ×105個(gè)/ml，在6 孔培養(yǎng)板的每孔中加入細(xì)胞懸液2 ml，待細(xì)胞貼壁良好后，向?qū)嶒?yàn)孔中加入濃度為75%的hMSC-CMs，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，于倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 流式細(xì)胞儀測(cè)定人胃癌MGC80-3 細(xì)胞凋亡用Rnase 酶消化已固定的人胃癌MGC80-3 細(xì)胞。在4 ℃條件下加入溴化丙啶(PI)1 ml 染色30 min，以500 目銅網(wǎng)過濾，制備待檢測(cè)的單細(xì)胞懸液。調(diào)整儀器的變異參數(shù)(CV)在2%以內(nèi)，激發(fā)光源為15 mW 氬離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)為488 mm。計(jì)算細(xì)胞凋亡百分率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以x ±s 的形式表示。多組間均數(shù)差異性的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hUCB-MSCs 的表型鑒定 采用流式細(xì)胞儀表型分析獲得的第4 代hUCB-MSCs 細(xì)胞表達(dá)情況為:高表達(dá)PE-CD73(97. 69%)、PE-CD90(100%)、PE-CD105(96. 59%);低表達(dá)FITC-CD19(0. 50%)、FITC-CD34(0.23%)、PE-CD11b(0.20%)、PE-CD45 (0.11%);對(duì)組織相容性表型分析顯示:低表達(dá)HLA-DR(0.07%)、PE-IgG(1.00%)、FITC-IgG(0.17%)。上述結(jié)果說明細(xì)胞均質(zhì)性好，符合本實(shí)驗(yàn)要求(見圖1)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型結(jié)果Fig 1 Phenotype of MSCs by flow cytometry

2.2 MTT 比色法分析結(jié)果 MTT 比色法分析濃度分別為25%、50%、75%、100%的MSC-CM 對(duì)MGC80-3 細(xì)胞增殖的作用，以不含MSC-CM 組作為空白對(duì)照組。結(jié)果顯示:MSC-CM 在25% ～100%濃度范圍內(nèi)對(duì)MGC80-3 細(xì)胞增殖具有較明顯的抑制作用，存在劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。不同濃度的MSC-CM 作用MGC80-3 細(xì)胞24 h、48 h、72 h 后，各實(shí)驗(yàn)組抑制率均有不同程度升高，與空白對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。抑制率以100%MSC-CM 作用72 h最高，達(dá)到(67.695 ±14.444)% (見圖2、表1)。

圖2 細(xì)胞抑制率的組間比較Fig 2 Comparison of inhibitory rates among groups

表1 MSC-CM 對(duì)MGC80-3 細(xì)胞增殖的影響(x±s)Tab 1 Effect of MSC-CM on the proliferation of MGC80-3 cells (x±s)

2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況 MGC80-3 細(xì)胞與濃度依次為0、25%、50%、75%MSC-CM 共培養(yǎng)72 h后，流式細(xì)胞儀可測(cè)得典型的亞二倍體凋亡峰，說明MSC-CM 能誘導(dǎo)MGC80-3 細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞凋亡率隨著MSC-CM 濃度的升高而升高。各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較及各實(shí)驗(yàn)組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見圖3 ～4、表2)。

圖3 細(xì)胞凋亡百分率的組間比較Fig 3 Comparison of apoptotic rate among groups

2.4 倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果 對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，貼壁緊密，細(xì)胞呈片狀融合，呈梭形，形態(tài)飽滿;而75%濃度的MSC-CM 作用72 h 后的細(xì)胞出現(xiàn)貼壁不良，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞固縮為圓形或卵圓形(見圖5)。

圖4 不同濃度的MSC-CM 對(duì)MGC80-3 細(xì)胞作用72 h 后測(cè)得的凋亡峰 A:對(duì)照組;B:25%濃度組;C:50%濃度組;D:75%濃度組Fig 4 Apoptotic rates of MGC80-3 cells treated by MSC-CM for 72 h with different concentration A. control group;B.25% concentration group;C. 50% concentration group;D.75%concentration group

圖5 作用72 h 后MGC80-3 細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下的表現(xiàn)(100 ×) A:對(duì)照組;B:75%濃度組Fig 5 Expression of MGC80-3 cells untreated with MSC-CM for 72 hours by inverted phase contrast microscopy (100 ×) A:control group;B:75% concentrotion group

3 討論

目前多數(shù)研究主要針對(duì)骨髓來源MSCs，但骨髓取材困難，供者難以接受，來源受到限制。相比較而言，hUCB-MSC 不僅保持了MSCs 的生物學(xué)特性，而且還具備如下優(yōu)點(diǎn):hUCB-MSC 更原始，增殖分化能力更強(qiáng);免疫原性低，一般不引起免疫反應(yīng);分離培養(yǎng)操作簡(jiǎn)便，易于工業(yè)化生產(chǎn);冷凍后可多次使用，且冷凍造成的細(xì)胞損傷小;潛伏性病毒和病原微生物的感染及傳播幾率比較低;取材方便，對(duì)產(chǎn)婦、新生兒無任何損傷及危害;易于保存、運(yùn)輸;無道德、倫理學(xué)的限制。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所使用的hUCB-MSC 進(jìn)行免疫表型和基因表型鑒定，證實(shí)hUCB-MSC 與其他來源的MSC 類似，高表達(dá)CD10、CD13、CD29、CD44、CD51、CD73、CD90、CD105 等;低表達(dá)或不表達(dá)CD14、CD33、CD34、CD45、CD56、HLA-G、HLA-DP、HLA-DQ、HLADR 等［2］。結(jié)果表明所使用的4 ～8 代hUCB-MSC 具備MSC 各項(xiàng)特征，符合實(shí)驗(yàn)要求。

本實(shí)驗(yàn)通過MTT 比色法研究臍帶血來源間充質(zhì)干細(xì)胞-條件培養(yǎng)基(the condition medium of MSCs，MSC-CM)在不同濃度范圍內(nèi)對(duì)人胃癌MGC80-3 細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同濃度MSC-CM 作用于MGC80-3 細(xì)胞24 h、48 h、72 h 后，各實(shí)驗(yàn)組抑制率均有不同程度升高，與空白對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，且有劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。隨著MSC-CM 濃度的提高、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)MGC80-3 細(xì)胞增殖的抑制率逐漸升高。通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，而腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化是評(píng)價(jià)誘導(dǎo)凋亡作用最簡(jiǎn)便、最直觀的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，貼壁緊密，細(xì)胞呈片狀融合，呈梭形，形態(tài)飽滿;而75%MSC-CM 作用72 h 后的細(xì)胞出現(xiàn)貼壁不良，細(xì)胞密度降低，細(xì)胞固縮為圓形或卵圓形。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行凋亡率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MGC80-3 細(xì)胞與濃度依次為0、25%、50%、75%MSC-CM 共培養(yǎng)72 h 后，流式細(xì)胞儀可測(cè)得典型的亞二倍體凋亡峰，說明MSC-CM 能誘導(dǎo)MGC80-3 細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨MSC-CM 濃度的增大而逐漸增高，MSC-CM 通過誘導(dǎo)MGC80-3 細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮抑制MGC80-3 細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

Lu 等［3］通過體外實(shí)驗(yàn)得出MSCs 可促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞(YAC-1、EL-4)、肝癌細(xì)胞H22 等凋亡，抑制上述腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Cho 等［4］發(fā)現(xiàn)MSCs 通過影響血管生成因子、趨化因子配體8、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合等的表達(dá)水平，使卵巢癌SK-OV-3 細(xì)胞核發(fā)生固縮，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在Ohlsson 等［5］進(jìn)行的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，將結(jié)腸癌細(xì)胞和MSCs 的混合物與基質(zhì)共同接種到大鼠皮下，MSCs 和結(jié)腸癌細(xì)胞數(shù)相等時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)完全被抑制。本研究結(jié)果顯示，hUCB-MSC 能明顯抑制人胃癌細(xì)胞株MGC80-3 細(xì)胞的體外增殖與轉(zhuǎn)移，且作用效果具有劑量和時(shí)間依賴性。

已有研究表明MSCs 抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制可能與以下因素有關(guān):(1)MSCs 通過降低Akt 信號(hào)通路中絲氨酸蘇氨酸激酶活性、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生p21、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡促進(jìn)因子caspase-3 等機(jī)制直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［3，6-7］。(2)通過分泌血管生成素-1(Ang-1)抑制腫瘤血管的滲漏和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)［8］，釋放Wnt 通路抑制因子DKK-1［9］等旁分泌機(jī)制發(fā)揮抑制作用。(3)作為抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生CD8+T 淋巴細(xì)胞依賴的抗腫瘤免疫反應(yīng)［10］。

基于目前多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究所得，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，認(rèn)為hUCB-MSC 對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖起抑制作用，深入研究其作用機(jī)制有可能對(duì)胃癌的臨床治療提供一定的依據(jù)。

［1］ Zhang Y，Huang PP. Biological properties and application prospects in human umbilical cord mesenchymal stem cells［J］. International Journal of Transplantation and Hemopurification，2007，5(4):39-42.張彥，黃平平.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及應(yīng)用前景［J］.國(guó)際移植與血液凈化雜志，2007，5(4):39-42.

［2］ Studeny M，Marini FC，Dembinski JL，et al. Mesenchymal stem cells:potential precursors for tumor stroma and targeted-delivery vehicles for anticancer agents ［J］. J Natl Cancer Inst，2004，96 (21):1593-1603.

［3］ Lu YR，Yuan Y，Wang XJ，et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stenl cells on tumor cells in vitro and in vivo［J］. Cancer Biol Ther，2008，7(2):245-251.

［4］ Cho JA，Park H，Kim HK，et al. Hyperthermia-treated mesenchymal stem cells exert antitumor effects on human carcinoma cell line［J］.Cancer，2009，115(2):311-323.

［5］ Ohlsson LB，Varas L，Kjellman C，et al. Mesenchymal progenitor cell-mediated inhibition of tumor growth in vivo and in vitro in gelatin matrix［J］.Exp Mol Pathol，2003，75(3):248-255.

［6］ Khakoo AY，Pati S，Anderson SA，et al. Human mesenchymal stenl cells expert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi's sarcoma［J］. J Exp Med，2006，203(5):1235-1247.

［7］ Sun B，Roh KH，Park JR，et al.Therapeutic potential of mesenchymal stromal cells in a mouse breast cancer metastasis mode［J］.Cytotherapy，2009，11(3):289-298.

［8］ Nakamura K，Ito Y，Kawano Y，et a1. Antitumor effect of genetically engineered mesenchymal stem cells in a rat glioma model［J］. Gene Ther，2004，11(14):1155-1164.

［9］ Etheridge SL，Spencer GJ，Heath DJ，et al. Expression profiling and functional analysis of wnt signaling mechanisma in mesenehymal stem cells［J］.Stem Cells ，2004，22(5):849-860.

［10］ Ma B，Ren J，Jang HF，et al. Antitumor activities against hepatocellular carcinoma induced by bone marrow mesenchymal stem cells pulsed with tumor-derived exosomes［J］. Journal of Peking University(Health Sciences)，2008，40(5):494-499.馬博，任軍，姜晗防，等. 腫瘤源性外切體負(fù)載的間充質(zhì)干細(xì)胞抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，40(5):494-499.