張 譽，胡 欣

中國人民解放軍第一〇五醫(yī)院干部病房，安徽 合肥230031

程序性凋亡受體1 (programmed death-1，PD-1)是具有單一胞外免疫球蛋白V 樣功能區(qū)的I 型穿膜蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員。PD-1 是程序性凋亡受體家族中的代表，也是B7/CD28 超家族中第2 個抑制性受體功能的受體，第1 個發(fā)現(xiàn)的抑制性功能細(xì)胞是毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(Cytotoxic T lymphocyteassociated antigen4，CTLA-4)。PD-1 和CTLA-4 都能有效抑制T 細(xì)胞免疫的初期活化，其中PD-1 能抑制T 細(xì)胞抗原受體(TCR)的信號傳導(dǎo)，與腫瘤發(fā)生及多種自身免疫性疾病密切相關(guān)，最初是在凋亡的T 細(xì)胞雜交瘤中利用消減雜交的方法得到的，又稱CD279，是近年來發(fā)現(xiàn)的負(fù)性共刺激信號之一，其高度表達與T 細(xì)胞免疫缺陷密切相關(guān)。T 細(xì)胞表面PD-1 及其配體(PD-1)結(jié)合的相互作用，抑制腫瘤抗原特異性T 細(xì)胞的活化，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸［1-3］。消化道腫瘤在全世界很多國家發(fā)病率都很高，中國是發(fā)病率較高的國家。消化道腫瘤早期癥狀隱匿，經(jīng)常到晚期才得到診斷。本研究目的在于通過檢測消化道腫瘤患者外周血T 細(xì)胞PD 的表達水平及病變程度，外周血T 細(xì)胞PD-1 的表達的水平與正常人的差異，探討PD-1 的表達與消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011 年1 月-2013 年12 月解放軍105 醫(yī)院消化道腫瘤患者58 例，男42 例，女16例;年齡45 ～75 歲，平均年齡(65 ±7.3)歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2010 中國版《消化道腫瘤臨床實踐指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4-5］，且均排除轉(zhuǎn)移性消化道腫瘤，術(shù)前均未行免疫干預(yù)治療，術(shù)后經(jīng)病理證實(見圖1)。其中胃癌27例，食管癌18 例，結(jié)腸癌13 例。對所有入組患者進行TNM 分期，其中I 期7 例，Ⅱ期13 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期10 例。健康對照組是體檢中心隨機選取的健康體檢者34 名，男25 例，女9 例;年齡45 ～75 歲，平均年齡(61.6 ±8.79)歲。所有入組患者及健康體檢者均簽署知情同意書，并且通過解放軍第105 醫(yī)院倫理委員會認(rèn)可。

圖1 消化道腫瘤病理圖 A:胃癌;B ～C:結(jié)腸癌;D:食管癌Fig 1 The pathological picture of degestive tumor A:gastric cancer;B ～C:colon cance;D:esophageal cance

1.2 主要試劑和儀器 人免疫學(xué)實驗所用PD-1 抗體購自美國BD 公司，來自小鼠及小鼠抗人PD-1，PE(藻紅蛋白)通道，同型對照為無熒光染色的鼠抗人IgG1。T 細(xì)胞分群主要是PerCP(多甲藻葉綠素蛋白)標(biāo)記的CD8，APC(別藻青蛋白)標(biāo)記的CD4 及其相應(yīng)的鼠抗人同型抗體購自eBioscience 公司，萊茲公司提供分裝。流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司，實驗用PBS 由本實驗室配制，微量移液器購自康寧公司。

1.3 主要檢測方法

1.3.1 免疫組化:常規(guī)固定包埋切片等過程省略，HE 染色過程:(1)將已入蒸餾水的切片放入蘇木精水溶液中染色10 min;(2)酸水及氨水中分色，各數(shù)秒鐘;(3)流水沖洗1 h 后入蒸餾水片刻;(4)入70%和90%酒精中脫水各10 min;(5)入酒精伊紅染色液染色2 ～3 min。

1.3.2 流式細(xì)胞儀分析T 細(xì)胞PD-1 的表達:批量標(biāo)本統(tǒng)一按以下程序檢測，先將新鮮血液分離PBMC，平均分入兩個流式檢測管中，各加入105左右個細(xì)胞，一支檢測管加入PerCp-CD8，20 μl，APC-CD4，PD-1-PE 20 μl;另一支試管加入同型對照抗體矯正熒光通道，20 ℃避光儲存30 min。加入1ml PBS 洗滌液除去未結(jié)合抗體，振蕩后離心1 500 r/min，棄上清，加入1%多聚甲醛固定，上機檢測，用Fac-FlowJo 軟件分析數(shù)據(jù)得出結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進行統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)用x-±s 表示，兩獨立樣本非參數(shù)檢驗比較兩組計量資料，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血CD8+T 細(xì)胞表面PD-1 的陽性表達情況

消化道腫瘤患者PD-1 在外周血CD8+T 細(xì)胞表面的陽性表達比例明顯高于健康對照者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見圖2)。

2.2 外周血CD8+T 細(xì)胞表面PD-1 的表達水平 外周血進行流式細(xì)胞儀分析結(jié)果:腫瘤組患者外周血CD8+T 細(xì)胞表面PD-1 陽性表達水平明顯高于健康對照組(7.22 ±4.27，P =0.0021 vs 16.72 ±4.21，P =0.0037)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見圖3A)。

2.3 PD-1 在腫瘤不同分期的表達 在4 種不同分期的消化道腫瘤患者外周血CD8+T 細(xì)胞表面PD-1 表達的頻率不同，且與消化道腫瘤的惡性度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見圖3B)。

圖2 CD8 +T 細(xì)胞表達PD-1 的典型圖Fig 2 The typical illustration of PD-1 in CD8 +T cell

圖3 外周血CD8 +T 細(xì)胞表面PD-1 的表達Fig 3 Expression of PD-1 in CD8 +T cells surface in peripheral blood

3 討論

隨著對腫瘤的生物學(xué)行為研究的不斷深入，腫瘤的免疫治療逐漸成為研究者關(guān)注的焦點，腫瘤的免疫療法是以激發(fā)和增強機體的免疫功能達到控制和殺滅腫瘤細(xì)胞為目的。免疫療法除能清除少量的、播散的腫瘤細(xì)胞，對于晚期的實體腫瘤用免疫療法清除殘存的腫瘤細(xì)胞，可提高腫瘤綜合治療的效果。腫瘤免疫治療可彌補傳統(tǒng)手術(shù)及放化療的不足，成為一種有效的療法而廣泛應(yīng)用于臨床。免疫治療與傳統(tǒng)療法的區(qū)別是針對靶點，有的放矢，減少對正常細(xì)胞的殺傷，高效、特異性的清除異性細(xì)胞。但是，腫瘤細(xì)胞是通過多種途徑逃避機體的免疫監(jiān)控和殺傷。因此，尋找特異性高、作用范圍廣的靶點成為關(guān)鍵。T 細(xì)胞對特異性抗原的應(yīng)答和耐受在維持機體免疫平衡的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PD-1 的高度表達與T 細(xì)胞免疫缺陷密切相關(guān)。在腫瘤免疫應(yīng)答過程中，腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡以及免疫反應(yīng)降低是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中的主要機制。研究發(fā)現(xiàn)PD-1 所在的信號通路正是許多癌細(xì)胞實現(xiàn)免疫逃逸的重要途徑［6-7］。T 細(xì)胞表面的PD-1 與其配體(PD-L1)結(jié)合后，可抑制腫瘤抗原特異性T 細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)并維持T 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞免疫耐受，導(dǎo)致腫瘤避免免疫殺傷［8］。研究表明，PD-1/PD-L1 信號通路抑制腫瘤抗原特異性T 細(xì)胞的活化，而阻斷PD-1/PD-L1 信號途徑后，腫瘤生長變得非常緩慢，因此，PD-1 通路是探討腫瘤免疫治療的一個新途徑［9］。同理，在人類癌組織中均可檢測到PD-1，即PD-L1 蛋白的表達［10］。有學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞分析泌尿系統(tǒng)癌細(xì)胞中PD-1 分子的表達，結(jié)果顯示CD4+/CD8+T 細(xì)胞上均高表達PD-1 分子，而且PD-1的表達強度與CD4+/CD8+之比呈負(fù)相關(guān)［11］。PD-1在乳腺癌細(xì)胞中的表達強度與癌組織的大小、病理分型及淋巴組織浸潤顯著呈正相關(guān)［15］。卵巢癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞PD-1 的表達水平與CD8+T 的浸潤程度及患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［15］。Konishi 等［14］在檢測到PD-1 在非小細(xì)胞肺癌中高表達。Shi 等［15］則在肝細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)PD-1 高表達。本研究結(jié)果顯示消化道腫瘤外周血CD8+T 細(xì)胞表面PD-1 的表達率較正常人明顯上調(diào)，且與消化道腫瘤的不同分型呈正相關(guān);關(guān)于PD-1/PDL1 信號通路和消化道腫瘤的磁系的研究正處于探索階段，仍需要進一步研究。

［1］ Dong H，Chen L. B7-H1 path way and its role in the evasion of tumor immunity［J］. J Mol Med (Berl)，2003，81(5):281-287.

［2］ Keir ME，Buttem J，F(xiàn)reeman GJ，et al. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity［J］.Annu Rev Immunol，2008，26:677-704.

［3］ Carter L，F(xiàn)ouser LA，Jussif J，et al. PD-1，PD-L inhibitory pathyway affects both CD4 + and CD8 +T cell and its overcome by IL-2［J］.Eur J Immunol，2002，32(3):634-643.

［4］ Ji JF. The interpretation of gastric cancer NCCN clinical practice guideline 2009 edition［J］. Chin J Gastrointest Surg，2009，12(2):107-109.季加孚.胃癌NCCN 臨床實踐指南2009 版解讀［J］.中華胃腸外科雜志，2009，12(2):107-109.

［5］ Yao HW，Liu YH. The interpretation of NCCN colorectal cancer clinical practice guidelines updated 2011 ［J］. Chin J Gastrointest Surg，2011，14(4):234-238.姚宏偉，劉蔭華. NCCN 結(jié)直腸癌臨床實踐指南2011 年更新解讀［J］.中華胃腸外科雜志，2011，14(4):234-238.

［6］ Dong H，Strome SE，Salomao DR，et al.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis:a potential mechanism of immune evasion［J］.Nat Med，2002，8(8):793-800.

［7］ Okazaki T，Honjo T. The PD-1/PD-L1 pathway in immunological tolerance［J］. Trends Immunol，2006，27(4):195-201.

［8］Francisco LM，Sage PT，Sharpe AH. The PD-1 pathway in tolerance and autoimmunity［J］. Immunol Rev，2010，236:219-242

［9］ Blank C，Kuball J，Voelkl S，et al. Blockade of PD-L1(B7-H1)augments human tumor-specific T cell responses in vitro［J］. Int J Cancer，2006，119(2):317-327.

［10］ Brown JA，Dorfman DM，Ma FR，et al. Blockade of programmed death-1 ligand on dendritic cells enhances T cell activation and cytokine production［J］. J Immunol，2003，170(3):1257-1266.

［11］ Nakanishi J，Wada Y，Matsumoto K，et al. Overexpression of B7-H1(PD-L1)significantly associates with tumor grade and postoperative prognosis in human urothelial cancers［J］. Cancer Immunol Immunother，2007，56(8):1173-1182.

［12］ Ghebeh H，Mohammed S，Al-Omair A，et al. The B7-H1 (PD-L1)T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma:correlation with important high-risk prognostic factors［J］. Neoplasia，2006，8(3):190-198.

［13］ Hamanishi J，Mandai M，Iwasaki M，et al. Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8 + T lymphocytes are prognostic factors of humanovarian cancer［J］. Proc Natl Aca Sci U S A，2007，104(9):3360-3365.

［14］ Konishi J，Yamazaki K，Azuma M，et al. B7-H1 expression on nonsmall cell lung cancer cells and its relationship with tumor-infiltrating lymphocytes and their PD-1 expression［J］. Clin Cancer Res，2004，10(15):5094-5100.

［15］ Shi F，Shi M，Zeng Z，et al. PD-1 and PD-L1 upregulation promotes CD8+T-cell apoptosis and postoperative recurrence in hepatocellular carcinoma patients［J］. Int J Cancer，2010，128(4):877-896.