鄭龍志，林 偉，陳有挺，石 錚，何慶良

1.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院普通外科，福建 莆田351100;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科

膽管癌是指來源于膽管系統(tǒng)上皮組織的惡性腫瘤，其起病隱匿、缺乏典型的癥狀和體征，早期診斷困難;臨床上根治性切除率低，且對放化療不敏感，預(yù)后較差。因此，探索一條新的有效的治療途徑，對于膽管癌的治療具有十分重要的意義。他汀類藥物的作用具有多效性，它除有降血脂作用外，還具有抗腫瘤方面的作用［1］。本研究旨在研究阿托伐他汀(Atorvastatin，ATV)對QBC939 細胞侵襲的影響，探討其抗腫瘤作用及其可能的作用機制。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):用人膽管癌QBC939 細胞進行培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 體外細胞殺傷實驗:應(yīng)用四唑鹽(MTT)比色法進行體外細胞殺傷實驗，細胞抑制率(%)=(對照組A 值-治療組A 值)/對照組A 值×100%;以時間為橫軸，細胞抑制率為縱軸繪制藥物濃度曲線圖，計算出藥物半數(shù)抑制濃度IC50及藥物最佳作用時間。藥物IC50為(26.361.84)μmol/L，本實驗選用接近IC50的3個濃度作為實驗濃度:10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L，并以最佳作用時間48 h 為干預(yù)時間。

1.2.3 Matrigel 侵襲實驗:取對數(shù)生長期QBC939 細胞，用無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌3 次，制成1 ×106個/ml 的單細胞懸液，將上述配制的各組細胞懸液100 μl，分別加入Transwell 小室中，待細胞貼壁后，加入含不同濃度阿伐他汀的培養(yǎng)液，每一濃度設(shè)3 個復(fù)室，以等量無藥液培養(yǎng)液為對照，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取下Transwell 微孔濾膜在4%甲醛液中固定30 min，常規(guī)HE 染色。400 倍光鏡下觀察，隨機取5 個高

1 材料與方法

1.1 材料 人膽管癌細胞株QBC939 由第三軍醫(yī)大學(xué)王曙光教授建株，董家鴻教授惠贈;Transwell 小室購自Corning 公司;Matrigel 膠購自美國BD 公司?？贵w:抗RhoC 多克隆抗體購自Upstate 公司，一步法RTPCR 試劑盒購自美國Invitrogen 公司。倍視野，計數(shù)透膜細胞總數(shù)。

1.2.4 半定量RT-PCR 分析RhoC mRNA 的表達:參照試劑盒說明書，采用Trizol 法提取細胞總RNA，一步法RT-PCR 擴增目的基因，紫外分光光度計測定RNA 含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x ±s 表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATV 對QBC939 細胞的殺傷抑制作用 ATV 對人膽管癌QBC939 細胞的殺傷抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強，在同一藥物濃度干預(yù)下，殺傷抑制作用隨干預(yù)時間的延長而漸增;呈劑量-時間雙效應(yīng)關(guān)系(見圖1)。

2.2 ATV 對QBC939 細胞Matrigel 體外侵襲力的影響 對照組QBC939 細胞過膜較多，體外侵襲能力強;藥物干預(yù)組隨著藥物濃度的提高，QBC939 細胞過膜逐漸減少，各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。結(jié)果表明，ATV 可抑制QBC939 細胞對體外模擬的基底膜的侵襲力，其抑制作用呈劑量效應(yīng)關(guān)系(見圖2 ～3)。2.3 半定量RT-PCR 分析RhoC mRNA 的表達 經(jīng)10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L ATV 干預(yù)組后細胞RhoC mRNA 的表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，見表1)。

圖1 不同濃度ATV 對QBC939 細胞增殖抑制作用Fig 1 Inhibitory effects of proliferation of different concentrations ATV on QBC939 cells

圖2 不同濃度ATV 作用48 h 后QBC939 細胞過膜情況 A:對照組;B:10 μmol/L 濃度組;C:25 μmol/L 濃度組;D:50 μmol/L濃度組Fig 2 The membrane filtration of different con-cerntrations ATV on QBC939 cells after 48 hours A:control group;B:10 μmol/L concentration group;C:25 μmol/L concentration group;D:50 μmol/L concentration group

3 討論

目前腫瘤的治療以現(xiàn)代分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和分子免疫學(xué)等前沿科學(xué)為基礎(chǔ)，強調(diào)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的分子基礎(chǔ)和治療的針對性、有效性。因而尋找一種既能抗腫瘤細胞增殖，又能降低腫瘤細胞遠處侵襲能力的抗腫瘤藥物，已成為近年來的研究熱點。

他汀類藥物是80 年代后期開發(fā)的一種新型調(diào)節(jié)血脂藥物，通過抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMGCoA)還原酶作用，減少甲羥戊酸(Mevalonic acid，MVA)合成及其下游產(chǎn)物，從而影響細胞許多重要的生物學(xué)功能:細胞膜構(gòu)成、糖蛋白合成、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞周期進展等［2］。因此，他汀類藥物作用的多效性除降血脂作用外，還包括逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮功能異常、抗氧化劑活性、免疫調(diào)節(jié)、減少室性心律失常及血樁形成等作用［1］。近年來的體外研究還發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物對多種腫瘤細胞有抑制增殖，誘導(dǎo)分化或凋亡，抑制血管發(fā)生，降低侵襲、轉(zhuǎn)移能力及增強放化療等作用，是一種潛在的抗腫瘤藥物［1］;兩個大型的臨床研究也證實了在正常人和黑色素瘤患者中，他汀類藥物具有預(yù)防及抗腫瘤作用［3-4］。

圖3 不同濃度ATV 對QBC939 細胞侵襲力的影響Fig 3 Effects of invasion in different concentrations ATV on QBC939 cell

Tab 1 Expression of RhoC mRNA after intervented with different concentrations of ATV intervention (x±s)

表1 不同濃度ATV 干預(yù)后RhoC mRNA 的表達情況(x±s)

Boyden 小室侵襲實驗是體外檢測腫瘤細胞侵襲力的經(jīng)典方法。本實驗通過Matrigel 侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)對照組QBC939 細胞透膜較多，體外運動能力較強;而經(jīng)ATV 處理過的人膽管癌QBC939 細胞，其穿透Matrigel 膠的細胞數(shù)目明顯減少，且隨著ATV 濃度的提高透膜細胞數(shù)目逐漸減少，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。ATV 藥物干預(yù)組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。本研究顯示，ATV 可以抑制腫瘤細胞的侵襲能力及運動能力。

他汀類藥物可以抑制RhoC 的GGPP 活化修飾，導(dǎo)致胞漿中RhoC 的非活性(GDP 結(jié)合)形式富集而降低膜上RhoC 與GTP 的結(jié)合能力有關(guān)，最終導(dǎo)致RhoC 活性降低;從而影響細胞信號傳導(dǎo)，降低其侵襲、轉(zhuǎn)移能力［5］。結(jié)合本次的實驗結(jié)果，我們推測:ATV 可能主要通過抑制腫瘤細胞Rho 蛋白的異戊烯化，即抑制Rho 的膜定位及其活性，從而影響細胞信號傳導(dǎo)，包括p27KIP1 蛋白的降解、RhoC 的GGPP 活化修飾及其對MMP-9 的調(diào)控，進一步影響到細胞的生長、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移等過程。在后續(xù)的實驗中我們將進一步探討ATV 對RhoC 蛋白的異戊烯化的影響。

因此，我們認為，ATV 可抑制細胞體外侵襲及運動能力，這可能為膽管癌的治療提供新的治療方法。

［1］ Calabro P，Yeh ET. The pleiotropic effects of statins［J］. Curr Opin Cardiol，2005，20(6):541-546.

［2］ Goldstein JL，Brown MS. Regulation of the mevalonate pathway［J］.Nature，1990，343(1):425-430.

［3］ Graaf MR，Richel DJ，van Noorden CJ，et al. Effects of statins and farnesyltransferase inhibitors on the development and progression of cancer［J］. Cancer Treat Rev，2004，30(7):609-641.

［4］ Mo H，Elson CE. Studies of the isoprenoid-mediated inhibition of mevalonate synthesis applied to cancer chemotherapy and chemoprevention［J］.Exp Biol Med，2004，229(7):567-585.

［5］ Collisson EA，Kleer C，Wu M. et al. Atorvastatin prevents RhoC isoprenylation，invasion，and metastasis in human melanoma cells［J］.Mol Cancer Ther，2003，2(10):941-948.