高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變,一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定,因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測序技術(shù),足見其劃時代的改變,同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能。目前,高通量測序開始廣泛應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上。
1 篩選結(jié)核分枝桿菌耐藥株差異基因
2014年9月份,中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室研究人員發(fā)表論文,旨在比較結(jié)核分枝桿菌中敏感株、多耐藥株、廣泛耐藥株三者間基因表達(dá)的差異,為進(jìn)一步針對耐藥菌株的研究提供方向。研究指出,通過高通量測序篩選得到一系列耐藥株差異表達(dá)基因,為未來對耐藥菌株的研究提供依據(jù)。
從深圳市第三人民醫(yī)院收集敏感株、多耐藥株、廣泛耐藥株各1株,提取菌株RNA,然后構(gòu)建cDNA文庫,使用GenomeAnalyzerIIx高通量測序儀進(jìn)行全基因組測序,經(jīng)過篩選比對后得到測序結(jié)果,再比較3個菌株間的基因表達(dá)差異。
高通量測序后共得到基因3968個。將耐藥株與敏感株的基因進(jìn)行比較,選取表達(dá)差異高于10倍的基因,篩選得到多耐藥株差異基因16個、廣泛耐藥株差異基因10個。這些表達(dá)差異基因大部分與毒素-抗毒素系統(tǒng)、PE/PPE家族蛋白、金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)。還在多耐藥株中發(fā)現(xiàn)了一系列高表達(dá)的前噬菌體基因及噬菌體整合相關(guān)的基因。2 癌基因圖譜分析新方法
來自美國Dana-Farber癌癥研究所等機(jī)構(gòu)的研究人員近日開發(fā)出一種大規(guī)模并行測序的策略,可對FFPE腫瘤樣本進(jìn)行癌基因的圖譜分析。在美國臨床腫瘤學(xué)會的年會上,Dana-Farber的腫瘤學(xué)家NikhilWagle報告了這一策略。這種新策略是建立在一種稱為OncoMap的質(zhì)譜方法上。兩年前,Dana-Farber的研究人員曾在《PLoSONE》上描述了這種突變分析平臺,它繪制出33個癌基因或腫瘤抑制基因中的約400個突變。Wagle認(rèn)為,盡管這種方法很有用,但它也存在一些局限。比如,它只能檢測少數(shù)基因中的已知突變。盡管它能夠檢測點突變,但是在尋找小的插入和缺失時卻能力有限,也會遺漏一些染色體擴(kuò)增和缺失。為了克服這些問題,研究人員提出了一種高通量的測序方法,從腫瘤中分離出基因組DNA,并生成帶有條形碼的Illumina測序文庫。研究人員隨后利用安捷倫的SureSelect捕獲系統(tǒng)來捕獲癌基因序列,之后測序。NikhilWagle和他的同事在10種癌細(xì)胞系中檢測了這種方法,并發(fā)現(xiàn)了SNP、插入缺失、染色體擴(kuò)增和缺失。例如,在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中,研究小組檢測到CDKN1A擴(kuò)增,以及JAK2和CDKN2A的缺失,這些改變隨后經(jīng)芯片分析驗證。之后,研究小組準(zhǔn)備做一個試驗性的研究,他們利用了10個乳腺癌和結(jié)腸癌的FFPE樣本以及2個對照樣本,產(chǎn)生了覆蓋目標(biāo)基因的序列,平均深度為102倍。他們鑒定出大量突變,包括KRAS、PIK3CA、TSC1及BRCA1的改變。此外,他們將試驗性研究的數(shù)據(jù)與OncoMap的結(jié)果相比較,發(fā)現(xiàn)這種新方法有著極高的靈敏度和特異性。