江樹勛，張 冰，邵碧英，繆婷玉，彭 娟，陳文炳，*

(1.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，福建省檢驗檢疫技術(shù)研究重點實驗室，福建福州 350001;2.福建農(nóng)林大學，福建福州 350003;3.廈門塔斯曼生物工程公司，福建廈門 361023)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的產(chǎn)生使動植物、微生物等生物體性狀改良成為可能［1］，包括生長性能、抗病、抗逆性、營養(yǎng)品質(zhì)［2］等。在中國，稻米產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的40%，是過半中國人的主糧［3］，從1988年首個可育的轉(zhuǎn)基因水稻植株培育成功［4］，基因工程技術(shù)在我國水稻品種改良上得到了廣泛的研究。目前已經(jīng)培育成功的轉(zhuǎn)基因水稻植株所攜帶的目的基因主要包括抗蟲、抗病、抗逆、抗除草劑和改善營養(yǎng)品質(zhì)等類型［5］。鑒于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性還未定性，世界各國仍將轉(zhuǎn)基因食品安全列為重點問題［6］。許多國家相繼制定了轉(zhuǎn)基因生物的管理法規(guī)，要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行標識［7］。挪威［8］是首個實行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品含量標識的國家，標識低限為2%:歐盟的標識低限［9］為1%。我國［10］于2001年5月23日頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，2002年3月20日開始貫徹實行《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》。

表1 熒光定量PCR引物/探針序列Table 1 The primer/probe sequence of fluorescence PCR

表2 引物、探針用量不同的3個PCR反應體系Table 2 Three PCR reaction systems of different dosage of primers and probe

目前轉(zhuǎn)基因檢測的對象已經(jīng)從一般農(nóng)產(chǎn)品擴展到深加工產(chǎn)品，如食用油脂、米制品、醬油、飼料等［11］，我國出口的米制品一直是歐盟等國家或地區(qū)檢測的重點［12］，對我國出口米制品影響很大。歐盟在2008年4月15日起對中國大米及其制品要求實施檢測并出具統(tǒng)一的衛(wèi)生證書才能出口［13］。但在轉(zhuǎn)基因成分檢測中，通常情況下提取DNA時僅要求把原料研磨成粉，一般不對顆粒細度提具體要求，這種情況下的主要顆粒細度為50～100目，同時存在大量小于50目和小量大于100目的顆粒，對溫育時間要求一般是1h(如大豆)或以上(如大米等)，由于這些條件往往無法穩(wěn)定滿足對深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測的準確性。為此，本文針對影響深加工米制品轉(zhuǎn)基因成分檢測的實時熒光PCR［14-16］結(jié)果準確性的各種因素進行研究，建立了規(guī)范的技術(shù)操作程序，為保障我國進出口米制品安全提供了科學檢測依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

非轉(zhuǎn)基因大米與米制品米粉干(線狀)為企業(yè)送檢留樣，科豐6號轉(zhuǎn)基因大米樣品(含CaMV35S、Nos、Cry1Ab、Ub-c外源基因成分)由福建省農(nóng)業(yè)科學院提供。CTAB十六烷基三甲基溴化銨;TE緩沖液、蛋白酶K與RNA分解酶等購自上海生工生物工程有限公司;Premix Ex Taq(2×)(Probe qPCR)試劑盒購自大連寶生物科技公司。大米內(nèi)源基因(GOS)與外源基因［17］(CaMV35S、NOS、Cry1Ab、Ub-c)擴增用的引物與探針由大連寶生物科技公司合成(表1)。

高速冷凍離心機 日立公司;臺式離心機 德國Eppendorf公司;核酸蛋白分析儀 德國Amersham公司;PCR超凈工作臺 美國Labconco公司;ABI7500實時熒光PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模擬轉(zhuǎn)基因米粉干樣品配制及DNA提取 按照四分法對每個非轉(zhuǎn)基因米粉干樣品分樣，稱取200g烘干研磨成細粉，分別制成＜50目、50～100目、＞100目3個細度范圍的樣品。相同方式制備科豐6號轉(zhuǎn)基因大米樣品，兩者按照相同細度和相應的質(zhì)量分數(shù)，分別配制轉(zhuǎn)基因大米含量為1%、0.1%、0.01%、0.001%4個轉(zhuǎn)基因含量梯度的模擬轉(zhuǎn)基因米粉干樣品，比如同等粒度的99.99g非轉(zhuǎn)基因米粉干粉末與0.01g轉(zhuǎn)基因大米粉末充分混勻，制成質(zhì)量分數(shù)為0.01%(m/m)的模擬轉(zhuǎn)基因米粉干。

采用 CTAB 法［18］提取 DNA。

1.2.2 熒光PCR反應體系與條件 設(shè)熒光PCR單管反應體積為20μL，引物與探針用量如表2。

實時熒光 PCR反應主程序為:95℃，10min;95℃，35s，60℃，60s，45 個循環(huán)。每個反應重復2 次。設(shè)置陰性對照、空白對照和陽性對照。閾值設(shè)定原則［19］根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整。

1.2.3 熒光PCR檢測 對不同含量和細度的108個樣本分別提取2份DNA，每個DNA做2個熒光PCR反應，即每個樣本做4個PCR重復，共檢測5個基因:大米內(nèi)源基因(GOS)與外源基因 CaMV35S、NOS、Cry1Ab、Ub-c(Kefeng 6)，總共進行 2160 管PCR反應，每次(96孔板)實驗都設(shè)置陽性對照、非轉(zhuǎn)基因大米陰性對照與雙蒸水(ddH2O)空白對照［20］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Office Excel 2003進行數(shù)據(jù)分析，對不同處理條件下樣品DNA質(zhì)量濃度與內(nèi)源和外源基因的實時熒光PCR檢測結(jié)果(Ct值)的差異顯著性進行方差分析，并估算邊際均值圖。

1.4 檢出率實驗

因檢驗檢疫領(lǐng)域通常認為熒光PCR轉(zhuǎn)基因成分的檢測限［21］為0.01%(轉(zhuǎn)基因含量0.01%樣品，檢出率達到95%以上)，本實驗擬在探究以上實驗得到的最優(yōu)樣品前處理方法的基礎(chǔ)上，探究了進一步提高熒光PCR轉(zhuǎn)基因成分的檢出率，即選用轉(zhuǎn)基因含量為0.001%的米粉干樣品，實驗其檢出陽性樣品的百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品顆粒細度及溫育時間對DNA提取效果影響

實驗設(shè)置了＜50目、50～10目、＞100目3個研磨顆粒細度和1、4、8h 3種CTAB溫育時間，表3為含量為0.01%的樣品提取的DNA濃度情況。

表3 米粉干樣品提取的DNA濃度(ng/μL)Table 3 The DNA concentration of rice noodle samples(ng/μL)

表3是米粉干樣品提取的9種處理組合下2個重復提取的DNA濃度平均數(shù)據(jù)，各個樣品的DNA質(zhì)量經(jīng)核酸蛋白分析儀測試，結(jié)果可知，DNA的OD260/OD280值都在1.7～2.0范圍內(nèi)，符合 PCR 檢測要求［22］。但是在相同的顆粒細度下，提取到的DNA濃度隨著溫育時間的增長而增高，溫育時間達到8h條件下效果最好;在溫育時間相同情況下，DNA濃度隨樣品顆粒細度的增加而增高，顆粒大小為＞100目的樣品提取到的DNA濃度最高。方差分析結(jié)果表明，樣品顆粒細度與CTAB緩沖液溫育時間對樣品DNA提取濃度的影響均達到極顯著水準(F行=73.00，F(xiàn)列=65.53，F(xiàn)0.01=18.00，p ＜0.01)。

2.2 熒光PCR反應體系優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1 引物、探針用量對檢測結(jié)果準確性的影響實驗樣品DNA為0.01%轉(zhuǎn)基因大米含量的米粉干樣品在研磨細度50～100目，CTAB緩沖液溫育時間達到8h條件下提取的DNA，測定3種引物、探針用量體系下內(nèi)源基因和外源基因?qū)崟r熒光PCR的Ct值，每個基因做4個重復。結(jié)果如表4。

表4結(jié)果顯示，PCR反應體系2測得的Ct值均比體系1和體系3的Ct值小，效果最好。

2.2.2 DNA模板濃度對檢測結(jié)果準確性的影響 采用2.2.1中的DNA原液及2倍和6倍稀釋液進行體系2實驗，測定了3個DNA濃度梯度樣品的內(nèi)源基因 GOS和外源基因 CaMV35S、NOS、Cry1Ab熒光PCR的Ct值。結(jié)果如表5。

表4 不同引物、探針用量下4個基因熒光PCR檢測結(jié)果(Ct值)Table 4 Fluorescence PCR detection results(Ct value)of 4 genes under different dosage of the primers and probe

表5 不同DNA濃度下4種基因熒光PCR檢測結(jié)果(Ct值)Table 5 Fluorescence PCR detection results(Ct value)of four genes under different concentration of DNA

從表5可以看出，DNA用量對檢測結(jié)果的Ct值影響明顯。DNA用原液時PCR檢測結(jié)果的Ct值最小，效果最理想。即DNA濃度較高時，Ct值相對較小，有利于提高熒光PCR檢測結(jié)果準確性。

2.3 不同含量梯度樣品對檢出結(jié)果的影響

對不同轉(zhuǎn)基因含量的米粉干樣品進行熒光PCR檢測，結(jié)果Ct值整理后利用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進行方差分析F檢驗，分析目數(shù)和溫育時間兩種因素間及兩種因素的交互作用對實驗結(jié)果影響的顯著性。同時利用Microsoft Office Excel 2003軟件對Ct值進行邊際均值估算，分析最優(yōu)處理組合。

由表6對4種轉(zhuǎn)基因含量大米樣品F檢驗結(jié)果表明，目數(shù)因素對0.001%含量的 CaMV35S、1%和0.1%含量的GOS影響不顯著，0.001%含量的NOS影響較顯著，其它均有極顯著影響;時間因素對1%含量的CaMV35S、0.01%含量的NOS和0.001%含量的Cry1Ab的影響較顯著，其它均有極顯著影響;兩因素間交互作用對1%、0.1%含量的GOS無顯著影響，僅對0.01%、0.001%含量情況下的GOS有極顯著影響，對1%和0.1%的CaMV35S、NOS、Cry1Ab以及0.1%的Ub-c有極顯著影響。

表6 米粉干樣品F檢驗Table 6 F test of dry rice noodle samples

以0.01%轉(zhuǎn)基因含量米粉干樣品為例，其4個外源基因檢測結(jié)果的估算邊際均值圖如圖1～圖4所示:

圖1 0.01%轉(zhuǎn)基因含量米粉干CaMV35S估算邊際均值Fig.1 Estimating marginal average figure of CaMV35S of 0.01%GM rice noodles

圖2 0.01%轉(zhuǎn)基因含量米粉干NOS估算邊際均值Fig.2 Estimating marginal average figure of NOS of 0.01%GM rice noodles

圖3 0.01%轉(zhuǎn)基因含量米粉干Cry1Ab估算邊際均值Fig.3 Estimating marginal average figure of Cry1Ab of 0.01%GM rice noodles

可見，對于4個外源基因Ct值最小時對應的樣品前處理條件都是樣品顆粒細度＞100目和溫育時間8h，其他不同轉(zhuǎn)基因含量米粉干樣品Ct值的估算邊際均值圖與此結(jié)論基本一致(圖略)，由此可確定米粉干樣品前處理的最佳組合是樣品顆粒細度＞100目和溫育時間8h。

圖4 0.01%轉(zhuǎn)基因含量米粉干Ub-c估算邊際均值Fig.4 Estimating marginal average figure of Ub-c of 0.01%GM rice noodles

2.4 檢出率實驗

以轉(zhuǎn)基因含量為0.001%的米粉干樣品進行檢出率實驗，測定外源基因CaMV35S、NOS、Cry1Ab的Ct值，結(jié)果如表7所示:

表7 轉(zhuǎn)基因含量0.001%的米粉干樣品檢出結(jié)果Table 7 Detection results of rice noodle samples with 0.001%content of genetically modified rice

表7表明，恰當?shù)那疤幚泶胧┛梢允沟脵z出限(以檢出率大于95%為指標)降低到轉(zhuǎn)基因含量0.001%，且PCR檢測的Ct值平均數(shù)(n=48)都在陽性結(jié)果判斷值(36)以下(表8)。

表8 經(jīng)最優(yōu)前處理后的米粉干模擬樣品轉(zhuǎn)基因成分Ct平均值Table 8 Average Ct values of transgenic components in simulated rice noodle samples after the optimum pre-treatment

3 結(jié)論

本文以模擬轉(zhuǎn)基因深加工米粉干為研究材料，探討了熒光PCR反應體系、樣品顆粒大小和DNA提取中樣品在CTAB緩沖液中的溫育時間對樣品DNA提取效果和熒光PCR檢測轉(zhuǎn)基因成分結(jié)果準確性的影響。

方差分析F檢驗結(jié)果表明，樣品顆粒細度與CTAB緩沖液浸泡溫育時間對DNA濃度產(chǎn)生的影響均達到極顯著水準，顆粒細度＞100目、CTAB緩沖液溫育時間達到8h的樣品提取的DNA濃度最高;不同處理條件下的大米內(nèi)源基因GOS與4個外源基因的Ct值存在顯著或極顯著影響，不管哪個基因，從估算邊際均值圖可以看出樣品細度與CTAB溫育時間的最佳組合是樣品顆粒細度＞100目與CTAB緩沖液溫育時間8h。在此基礎(chǔ)上進行的檢出率實驗說明，前處理對檢出率有顯著影響，恰當?shù)那疤幚泶胧┛梢允沟脵z出限(以檢出率大于95%為指標)降低到轉(zhuǎn)基因含量0.001%，是熒光PCR通常認為的檢出限0.01%的10倍，且PCR檢測的Ct值平均數(shù)(n=48)都在陽性結(jié)果判斷值(36)以下［參考轉(zhuǎn)基因檢測標準SN/T 2584-2010］。說明恰當?shù)臉悠非疤幚泶胧┘由蟽?yōu)化的熒光PCR反應體系條件可使不同轉(zhuǎn)基因含量樣品檢出效果更為理想，并能在一定程度上降低檢測限，這將對檢測相關(guān)產(chǎn)品的深加工轉(zhuǎn)基因食品的檢測具有重要參考意義，實踐證明應用該條件在對本實驗室檢測米粉干等深加工產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分中起到較好的效果。

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