陳 晨，趙 偉，楊瑞金，顧艷潔

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122;2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

高壓脈沖電場(chǎng)(PEF)技術(shù)能夠有效地殺滅食品中腐敗菌和致病菌，同時(shí)能夠較好保持食品固有的營(yíng)養(yǎng)成分［1］。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者在研究大量PEF不同體系的殺菌效果同時(shí)，已開始對(duì)PEF的殺菌機(jī)理展開進(jìn)一步的研究。有研究表明，PEF等非熱殺菌方式除殺滅部分微生物外，還會(huì)形成一定比例的損傷亞致死細(xì)胞，亞致死微生物在特定的環(huán)境下可以進(jìn)行自我修復(fù)［2-4］，恢復(fù)其自身繁殖能力，這使得直接對(duì)食品安全和貨架期造成不良的影響。因此，研究亞致死微生物的修復(fù)條件，從而進(jìn)一步滅活微生物和驗(yàn)證PEF殺菌食品的安全性是非常必要。陳曉嬋等人［5］對(duì)比研究了高壓脈沖電場(chǎng)對(duì)草莓汁中大腸桿菌和釀酒酵母損傷亞致死細(xì)胞產(chǎn)生的影響，同時(shí)還探究發(fā)現(xiàn)了PEF處理后冷臧或溫和熱處理都可以抑制亞致死釀酒酵母修復(fù)或使其進(jìn)一步死亡。Somolinos［6］等選用不同 pH培養(yǎng)基研究了 PEF處理下下亞損傷釀酒酵母細(xì)胞的自我修復(fù)情況。Pernic［7］等人以大腸桿菌和沙門氏菌作為目標(biāo)微生物，提出PEF亞致死損傷是一個(gè)累積的過程。

釀酒酵母是液體食品(乳制品、果蔬汁、非酒精性飲料等)中的常見污染菌種，對(duì)各種防腐劑、電離輻射照射、冷凍等的抵抗性強(qiáng)［8］。草莓營(yíng)養(yǎng)豐富，常規(guī)熱殺菌會(huì)造成熱敏性活性成分流失，降低了草莓汁的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始傾向于利用PEF等非熱加工技術(shù)對(duì)草莓汁等果蔬飲品進(jìn)行殺菌研究，以便于應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。在釀酒酵母生長(zhǎng)過程中，除需碳源、氮源和生物素外，還需要K+、Ca2+、Mg2+等無(wú)機(jī)金屬離子作為生長(zhǎng)因子，培養(yǎng)環(huán)境中金屬離子的含量影響著釀酒酵母的生理代謝活動(dòng)［9-10］。

本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母作為研究模型，以培養(yǎng)體系和金屬離子作為研究平臺(tái)，選用模擬體系和實(shí)際體系(草莓汁體系)，初步研究了培養(yǎng)體系和金屬離子對(duì)PEF作用下對(duì)亞致死損傷釀酒酵母的影響。為PEF殺菌機(jī)理提供進(jìn)一步的研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母菌 江南大學(xué)食品酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，菌種編號(hào)C-03;酵母浸出粉LP0021 英國(guó)OXOID公司;蛋白胨F403、葡萄糖、氯化鈉、無(wú)水氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀 均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

OSU-4L型實(shí)驗(yàn)室規(guī)模PEF連續(xù)處理設(shè)備 美國(guó)俄亥俄州立大學(xué);DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;XSW-CJ-2A標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái) 吳江市綠葉空調(diào)凈化有限公司;QYC2102-C型恒溫培養(yǎng)搖床 上海新苗醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物的活化培養(yǎng)與接種 釀酒酵母(C-03)由酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)瓊脂斜面培養(yǎng)基移至YPD液體培養(yǎng)基，30℃搖床200r/min培養(yǎng)16～20h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。菌液在4℃條件下冷凍離心(8000r/min，6min)得到菌液沉淀，用pH7.2滅菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)洗2次后重懸，菌懸液濃度達(dá)到107～108CFU/mL，電導(dǎo)率約為2000μs/cm。

1.2.2 模擬體系和實(shí)際體系配制 模擬體系一:主要是以酵母浸出粉、蛋白胨 F403和葡萄糖配制0.1%酵母浸出粉緩沖溶液、0.1%蛋白胨緩沖溶液、0.1%葡萄糖緩沖溶液作為目標(biāo)體系，可利用PBS調(diào)節(jié)電導(dǎo)率至3000μs/cm左右。模擬體系二:在以pH7.2滅菌的PBS菌懸液中，用無(wú)水氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀在緩沖體系添加不同濃度的金屬離子。實(shí)際體系:選用新鮮草莓汁，將市售新鮮草莓洗凈后，按料液比1∶6，用果汁機(jī)榨汁，用離心機(jī)離心(3000r/min，15min)獲取上清液，抽濾后草莓汁電導(dǎo)率約為3000μs/cm，用無(wú)水氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀在草莓汁中添加不同濃度的金屬離子。以上均將10mL培養(yǎng)液1.2.1接種至90mL不同處理體系中。

1.2.3 高壓脈沖電場(chǎng)殺菌 采用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模連續(xù)PEF處理設(shè)備，脈沖電場(chǎng)為雙極方形波脈沖電場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)室選擇6個(gè)連續(xù)處理腔，選用了電場(chǎng)強(qiáng)度20kV/cm，處理循環(huán)時(shí)間為400μs，脈沖寬度 2μs，脈沖頻率200Hz，循環(huán)式冷卻水浴的溫度為15℃。PEF殺菌處理后的不同樣品在室溫下放置 0、5、30、50、70、120 和150min進(jìn)行修復(fù)研究。

1.2.4 選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基 采用選擇性平板法測(cè)定亞致死損傷微生物，計(jì)數(shù)參照Perni等的方法［7］。受損失的酵母細(xì)胞在正常培養(yǎng)基上可以進(jìn)行生長(zhǎng)，但是在高滲透環(huán)境下無(wú)法維持滲透平衡，故不能生長(zhǎng);而未受損傷的酵母細(xì)胞可以在適度的高滲透環(huán)境下生長(zhǎng)。故選用兩種培養(yǎng)基進(jìn)行亞致死損傷微生物的測(cè)定:一種是正常的非選擇性培養(yǎng)基，另一種是選擇性高滲透培養(yǎng)基，以顧艷潔等人［11］確定的4%NaCl濃度為釀酒酵母細(xì)胞的臨界滲透壓，即常規(guī)培養(yǎng)基補(bǔ)加4%NaCl。

1.2.5 微生物計(jì)數(shù) 根據(jù)GB/T4789.2-2003方法，對(duì)PEF處理前后的菌液采用菌落平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。通過將菌液用0.85%生理鹽水以10倍稀釋法進(jìn)行逐級(jí)稀釋，選擇合適的稀釋度，吸取1.0mL稀釋樣于滅菌平皿中與培養(yǎng)基混合搖勻，于(30±0.1)℃條件下培養(yǎng)24h并計(jì)數(shù)。

1.2.6 cFDA標(biāo)記 羧基熒光素乙酰乙酸(cFDA)是一種親脂性、無(wú)熒光的物質(zhì)，能夠自由穿越細(xì)胞膜，可用來評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)酶活力。cFDA進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被細(xì)胞內(nèi)非特異性酯酶水解生成極性、不能穿過細(xì)胞膜的熒光物質(zhì)—羧基熒光素(cF)。cF標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)488nm激發(fā)后可在530nm發(fā)射綠色熒光，熒光越強(qiáng)表明細(xì)胞非特異性內(nèi)酯酶活越強(qiáng)。取PEF處理前后的釀酒酵母菌懸液1.0mL用cFDA染液(終濃度為5μg/mL)37℃避光染色30min，PBS反復(fù)沖洗兩次去除多余的染料。

1.2.7 釀酒酵母非特異性內(nèi)酯酶活力的測(cè)定 經(jīng)cFDA染色后的酵母細(xì)胞用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)FSC、SSC及FL1熒光通道(綠色)的各項(xiàng)指標(biāo)。每個(gè)樣品檢測(cè)20000個(gè)細(xì)胞。采用488nm激發(fā)光，cFDA標(biāo)記細(xì)胞在530nm處發(fā)綠色熒光，通過FL1通道檢測(cè)，數(shù)據(jù)采集后用CellQuest Pro軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同緩沖體系中亞致死損傷釀酒酵母的修復(fù)

參考 Garc?á，Somolinos 等人［6］對(duì) PEF 處理后大腸桿菌及釀酒酵母修復(fù)情況考察時(shí)的培養(yǎng)液選取原則，選取相同電導(dǎo)率的0.1%酵母浸出粉緩沖溶液、0.1%蛋白胨緩沖溶液、0.1%葡萄糖緩沖溶液作為釀酒酵母的培養(yǎng)修復(fù)環(huán)境，采用選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果如表1～表3所示。

通過相同條件PEF處理后，三種緩沖體系中釀酒酵母的存活情況及亞致死損傷釀酒酵母的修復(fù)均存在差異。在0.1%酵母浸出粉緩沖體系中，PEF處理后亞損傷酵母細(xì)胞約為2個(gè)對(duì)數(shù)，在0.1%蛋白胨緩沖體系中，PEF處理后亞損傷酵母細(xì)胞約為1個(gè)對(duì)數(shù)，而在0.1%葡萄糖緩沖體系中，PEF處理后亞損傷酵母細(xì)胞約為0.8個(gè)對(duì)數(shù)。亞致死損傷酵母的修復(fù)速度在成分相對(duì)豐富的酵母浸出粉緩沖體系與蛋白胨緩沖體系中遠(yuǎn)快于成分較為單一的葡萄糖緩沖體系，在酵母浸出粉緩沖體系與蛋白胨緩沖液中處理后30min內(nèi)損傷細(xì)胞即基本修復(fù)完畢，在葡萄糖緩沖液中處理后120min左右損傷細(xì)胞才修復(fù)完全。

表1 0.1%酵母浸出粉緩沖體系中PEF處理后釀酒酵母的修復(fù)Table 1 The recovery of PEF treated S.cerevisiae in 0.1%Yeast extract solution

表2 0.1%蛋白胨緩沖體系中PEF處理后釀酒酵母的修復(fù)Table 2 The recovery of PEF treated S.cerevisiae in 0.1%Peptone solution

圖1 不同添加量的金屬離子Ca2+對(duì)釀酒酵母存活量的影響Fig.1 Effect of different addition of metal ions Ca2+on the survival of S.cerevisiae cells

2.2 金屬離子對(duì)模擬體系中亞致死損傷釀酒酵母的修復(fù)

無(wú)機(jī)鹽離子是釀酒酵母生長(zhǎng)過程中必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中 Na、K、Ca、Mg等金屬陽(yáng)離子對(duì)釀酒酵母的正常生理機(jī)能有著重要的影響。本實(shí)驗(yàn)初步選取K、Ca、Mg三種均對(duì)酶有一定激活作用的金屬離子考察其對(duì)PEF處理后亞致死釀酒酵母細(xì)胞的修復(fù)作用。

參照釀酒酵母生長(zhǎng)過程中三種離子的最適添加量以及蘋果、草莓等常見水果中三種金屬離子的一般含量，分別向釀酒酵母緩沖溶液中添加不同濃度的金屬離子，同時(shí)保證微生物初始濃度在一個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。PEF處理前后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，得到釀酒酵母的存活情況如圖1～圖3所示。

在未添加特定金屬離子的對(duì)照組，PEF處理后釀酒酵母存活對(duì)數(shù)約為2.3～3.0個(gè)對(duì)數(shù)，存活細(xì)胞中亞致死損傷釀酒酵母的所占比例約為40%左右，PEF處理后亞致死酵母細(xì)胞存活對(duì)數(shù)約為1個(gè)對(duì)數(shù)，證明PEF處理后有亞致死酵母細(xì)胞的存在。

從圖1可見，當(dāng)Ca2+濃度升至50mg/L后，對(duì)酵母細(xì)胞存活有顯著影響(p＜0.05)，可見Ca2+存在會(huì)影響酵母的存活。而當(dāng)Ca2+濃度升至200mg/L，非選擇性培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基分別檢測(cè)酵母存活對(duì)數(shù)為4.31和4.36個(gè)對(duì)數(shù)，說明修復(fù)完全。從圖2可見，當(dāng)Mg2+濃度升至30mg/L后，酵母存活對(duì)數(shù)顯著提高至約4.7個(gè)對(duì)數(shù)，而隨著離子濃度的增加，存活不同大寫或小寫字母代表不同培養(yǎng)基的差異性(p＜0.05)。

圖2 不同添加量的金屬離子Mg2+對(duì)釀酒酵母存活量的影響Fig.2 Effect of different addition of metal ions Mg2+on the survival of S.cerevisiae cells

不同大寫或小寫字母代表不同培養(yǎng)基的差異性(p＜0.05)。對(duì)數(shù)略有所下降，當(dāng)離子濃度到達(dá)100mg/L，存活對(duì)不同大寫或小寫字母代表不同培養(yǎng)基的差異性(p＜0.05)。數(shù)變化不顯著(p＞0.05)。說明在 Mg2+濃度升至30mg/L后，已修復(fù)完全。從圖3可見，當(dāng)K+濃度升至0.8g/L后，酵母存活對(duì)數(shù)顯著提高至4.4個(gè)對(duì)數(shù)，已修復(fù)完全。但隨著離子濃度的提高，會(huì)對(duì)酵母菌的存活產(chǎn)生一定的副作用。

圖3 不同添加量的金屬離子K+對(duì)釀酒酵母存活量的影響Fig.3 Effect of different addition of metal ions K+on the survival of S.cerevisiae cells

考慮到K、Ca、Mg三種金屬離子均對(duì)酶有一定激活作用，初步以釀酒酵母內(nèi)酯酶為研究對(duì)象，應(yīng)用cFDA對(duì)酵母進(jìn)行熒光標(biāo)記能夠反應(yīng)酵母的酯酶和蛋白的水平，從而反應(yīng)酵母的活性。

選取約20000個(gè)細(xì)胞，以cFDA標(biāo)記釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)酯酶，F(xiàn)AM使光越強(qiáng)表明細(xì)胞非特異性內(nèi)酯酶活越強(qiáng)，如圖4所示，三種金屬離子的添加對(duì)釀酒酵母的非特異性內(nèi)酯酶活均產(chǎn)生了不同程度的影響。Ca2+的添加使得釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)酯酶活呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì);Mg2+的添加使得釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)酯酶活呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)的趨勢(shì);而K+的添加使得釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)酯酶活呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。說明三種金屬離子添加對(duì)亞致死損傷釀酒酵母細(xì)胞的修復(fù)也部分體現(xiàn)在于對(duì)非特異性內(nèi)酯酶的修復(fù)。金屬離子的添加對(duì)PEF處理下酵母細(xì)胞內(nèi)酯酶的修復(fù)是個(gè)較為復(fù)雜的過程，目前研究未能闡述其影響機(jī)理。

2.3 金屬離子對(duì)食品體系中亞致死損傷釀酒酵母的修復(fù)

為了更全面的反映三種金屬離子對(duì)亞致死損傷酵母細(xì)胞的修復(fù)作用，選取鮮榨草莓汁作為實(shí)際食品體系，三種離子的添加量與緩沖體系中保持一致，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，得到釀酒酵母的存活情況如圖5～圖7所示。

從圖5可見，在未添加特定金屬離子的對(duì)照組中，PEF處理后產(chǎn)生亞致死酵母細(xì)胞約為0.5個(gè)對(duì)數(shù)。金屬陽(yáng)離子的添加對(duì)鮮榨草莓汁中亞致死損傷酵母細(xì)胞的修復(fù)產(chǎn)生了一定的促進(jìn)效果。當(dāng)Ca2+濃度升至50mg/L后，Ca2+添加對(duì)酵母細(xì)胞存活有顯著影響(p＜0.05)，酵母存活對(duì)數(shù)約達(dá)至3個(gè)對(duì)數(shù)，且修復(fù)完全。Ca2+主要以離子狀態(tài)存在于細(xì)胞中以控制細(xì)胞的生理狀態(tài)，如調(diào)節(jié)膜的透性、激活酶等。馮玉娟等［12］曾指出釀酒酵母的生長(zhǎng)代謝速度隨著Ca2+的添加量而加快，而當(dāng)Ca2+濃度超過一定量之后釀酒酵母生長(zhǎng)會(huì)受到抑制。Yamada等人在對(duì) Ca2+-ATPase活力的測(cè)定中已經(jīng)得知PEF處理會(huì)顯著增加釀酒酵母中Ca2+-ATPase的活力，因此可以推測(cè)當(dāng)緩沖體系中額外添加Ca2+后，釀酒酵母依賴于高爾基體上活躍的Ca2+-ATPase將胞外Ca2+運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)，從而加快損傷釀酒酵母的修復(fù)速度［13］。

圖4 不同添加量的金屬離子對(duì)釀酒酵母內(nèi)酯酶活的影響Fig.4 Effect of different addition of metal ions on the lactone enzyme activity of S.cerevisiae cells

圖5 不同添加量的金屬離子Ca2+對(duì)草莓汁中釀酒酵母存活量的影響Fig.5 Effect of different addition of metal ions Ca2+on the sublethally injured percentage of S.cerevisiae in Strawberry juice

圖6 不同添加量的金屬離子Mg2+對(duì)草莓汁中釀酒酵母存活量的影響Fig.6 Effect of different addition of metal ions Mg2+on the sublethally injured percentage of S.cerevisiae in Strawberry juice

圖7 不同添加量的金屬離子K+對(duì)草莓汁中釀酒酵母存活量的影響Fig.7 Effect of different addition of metal ions K+on the sublethally injured percentage of S.cerevisiae in Strawberry juice

從圖6可見，當(dāng)Mg2+濃度升至30mg/L，Mg2+的添加對(duì)酵母存活對(duì)數(shù)影響顯著(p＜0.05)，當(dāng)Mg2+濃度升至50mg/L和80mg/L，Mg2+濃度的添加對(duì)酵母存活數(shù)影響不顯著(p＜0.05)，隨著濃度提高，會(huì)對(duì)酵母菌的存活產(chǎn)生一定的副作用，表現(xiàn)在釀酒酵母存活對(duì)數(shù)的下降。

從圖7可見，在未添加特定金屬離子的對(duì)照組中，PEF處理后亞致死酵母細(xì)胞約為0.8個(gè)對(duì)數(shù)，當(dāng)K+濃度升至0.8g/L后，K+的添加對(duì)酵母細(xì)胞存活有顯著影響(p＜0.05)，酵母存活對(duì)數(shù)約達(dá)至4個(gè)對(duì)數(shù)。隨著濃度提高，酵母存活對(duì)數(shù)下降，殺菌效果反而提高。可能是由于釀酒酵母在受到PEF處理刺激時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性、滲透壓及膜電位改變，從而可能引起K+外流。當(dāng)緩沖體系中額外加入K+后，胞外K+滲透壓高于胞內(nèi)，阻止了酵母細(xì)胞內(nèi)K+外流現(xiàn)象，同時(shí)刺激了酵母內(nèi)酯酶活，促進(jìn)亞致死損傷釀酒酵母細(xì)胞的修復(fù)。

3 結(jié)論

在單一的葡萄糖緩沖體系存在的亞損傷酵母細(xì)胞較復(fù)雜成分的酵母浸出粉、蛋白胨溶液少。亞致死酵母細(xì)胞在以YPD培養(yǎng)基為主要成分的酵母浸出粉、蛋白胨和葡萄糖緩沖溶液于30～70min內(nèi)完成修復(fù)。

在模擬體系中，未添加特定金屬離子的對(duì)照組均存在亞損傷酵母細(xì)胞。當(dāng)Ca2+濃度升至50mg/L，Mg2+濃度升至30mg/L，當(dāng)K+濃度升至0.8g/L后，亞致死損傷細(xì)胞均已修復(fù)。

在真實(shí)草莓汁體系中，當(dāng)Ca2+濃度升至50mg/L，K+濃度升至0.8g/L后，亞致死損傷細(xì)胞均已修復(fù)。Mg2+離子的添加對(duì)PEF作用下亞致死酵母修復(fù)影響不顯著，但隨著離子濃度的增加，PEF對(duì)酵母細(xì)胞殺菌效果先降后升。

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