林國文 ，葉定偉，戴 波，張海梁，沈益君，朱 耀，朱一平，施國海，馬春光，肖文軍，秦曉健，曹達(dá)龍

（復(fù)旦大學(xué)：1.附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科；2.上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032）

去勢抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer，CRPC）治療手段有限，預(yù)后差。多數(shù)確診晚期的前列腺癌患者經(jīng)過1.5～2年內(nèi)分泌治療后，不可避免進(jìn)展為CRPC 階段，其發(fā)生機(jī)制至今未明。近年有報道膜聯(lián)蛋白7（Annexin A7，ANXA7）與前列腺癌進(jìn)展關(guān)系密切［1－2］，但對激素敏感前列腺癌（hormone sensitive prostate cancer，HSPC）進(jìn)展為CRPC過程中ANXA7的作用尚不明確。本文利用免疫組化技術(shù)檢測ANXA7蛋白在轉(zhuǎn)移性HSPC患者的原發(fā)灶組織中表達(dá)情況，并探討其表達(dá)差異的對預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2003年6月至2013年6月本院資料完整的轉(zhuǎn)移性HSPC 患者106例，均經(jīng)病理證實(shí)且確診時已發(fā)生骨轉(zhuǎn)移?；颊吣挲g56～89歲，平均年齡70歲；確診時血清PSA 3～5 577ng／mL，中位值為170ng／mL；采用TNM 分期，T1～T2期22例，T3期59例，T4期25例；N0期65例，N1期41例；Gleason評分＜8分36例，≥8分70例。另取前列腺增生組織20 例、CRPC 原發(fā)灶組織22 例作比較。CRPC判斷標(biāo)準(zhǔn)（文獻(xiàn)［3］）：①血清睪酮達(dá)去勢水平（＜50ng／dL）；②間隔2周連續(xù)3次PSA 升高；③二線內(nèi)分泌治療期間PSA 進(jìn)展；④可出現(xiàn)骨或軟組織病變進(jìn)展。所有患者臨床資料由原始病史獲得，內(nèi)分泌治療采用最大限度雄激素阻斷方法。生存期隨訪時間截止為2014年3月。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色方法 上述病例的原發(fā)灶組織石蠟切片脫蠟水化，采取煮沸修復(fù)（置入pH 值為8.0的EDTA 抗原修復(fù)液，煮沸30min）；PBS沖洗后滴加50μL 一抗（ANXA7，兔抗人，1∶60，ProteinTech公司），4℃過夜；PBS沖洗后滴加通用二抗，室溫下孵育60min；PBS沖洗后滴加100μL DBA 顯色液；蒸餾水沖洗，0.1%鹽酸分化，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，香柏油封固。顯微鏡下觀察，陽性顯色為棕黃色顆粒，陰性對照采用PBS緩沖液代替一抗。

1.2.2 結(jié)果分析 ANXA7 表達(dá)定位于胞核和胞質(zhì)，陽性細(xì)胞為棕黃或棕褐色［4］。按陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分率計算。400倍高倍鏡下觀察至少5 個視野，取其平均值。根據(jù)染色強(qiáng)度分為3個等級：陰性表達(dá)（－）：＜10%細(xì)胞出現(xiàn)著色；弱陽性表達(dá)（＋）：＞10%細(xì)胞出現(xiàn)輕中度著色；強(qiáng)陽性表達(dá)（＋＋）：＞10%細(xì)胞出現(xiàn)重度著色。切片由我院2位病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片。

1.2.3 預(yù)后指標(biāo) 疾病無進(jìn)展生存期（progressionfree survival，PFS）定義為從一線激素治療開始到進(jìn)入CRPC階段的時間長度；總生存期（overall survival，OS）定義為從一線激素治療開始到因任何原因患者死亡的時間長度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，ANXA7在前列腺增生以及轉(zhuǎn)移性前列腺癌間表達(dá)差異，以及ANXA7表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)分析通過χ2檢驗(yàn)完成，生存分析采用單因素和多因素Cox回歸模型，P＜0.05提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)移性HSPC 和前列腺增生組織中ANXA7蛋白的表達(dá) ANXA7蛋白均在兩類組織中表達(dá)，顯微鏡下可見細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)DAB 染色的棕黃色顆粒。其中，轉(zhuǎn)移性HSPC 組織陽性表達(dá)率50／106（47.2%）；前列腺增生組織全部陽性表達(dá)。前者的ANXA7蛋白陽性率明顯低于后者，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1A、1B、1C）。

圖1 轉(zhuǎn)移性HSPC和前列腺增生組織中ANXA7蛋白的表達(dá)（免疫組化，×400）

2.2 轉(zhuǎn)移性HSPC與CRPC組織中ANXA7蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)移性HSPC 組織陽性表達(dá)率50／106（47.2%），CRPC 組織陽性表達(dá)率為3／22（13.6%）。其中，轉(zhuǎn)移性HSPC 和CRPC 組織中弱陽性率分別為44／106（41.5%）和3／22（13.6%），而強(qiáng)陽性率則為6／106（5.7%）和0，統(tǒng)計分析提示CRPC組相比前者ANXA7蛋白陽性表達(dá)率明顯降低，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.014，圖1A、1B、1D）。

2.3 ANXA7蛋白表達(dá)與轉(zhuǎn)移性HSPC 患者臨床病理特征的關(guān)系 將106例轉(zhuǎn)移性HSPC 患者病例進(jìn)行相關(guān)分析比較（表1）。ANXA7蛋白表達(dá)率與患者T 分期、N 分期和Gleason分期關(guān)系密切，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 ANXA7蛋白表達(dá)與轉(zhuǎn)移性HSPC患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.4 ANXA7蛋白表達(dá)與HSPC 的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者PFS與OS 的相關(guān)分析 至隨訪結(jié)束，80.2%（85／106例）患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，PFS中位值為21.3月；62.3%（66／106例）患者最終死亡，OS 中位值為39.1月。將106 例HSPC 患者臨床病理特征及其ANXA7蛋白表達(dá)情況納入Cox回歸模型（表2、表3），單因素分析PFS相關(guān)因素包括ANXA7 蛋白表達(dá)、活檢Gleason評分，OS相關(guān)因素包括ANXA7蛋白表達(dá)、PSA 最低值、多西他賽化療療程；多因素分析提示僅ANXA7蛋白表達(dá)與PFS 正相關(guān)（陽性表達(dá)者PFS 中位值為24.4月、陰性表達(dá)者為15.5月），ANXA7蛋白表達(dá)、PSA 最低值＜0.4ng／mL與OS正相關(guān)（陽性表達(dá)者OS中位值為56.4月、陰性表達(dá)者為36.1月），差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

圖2 ANXA7蛋白差異表達(dá)的轉(zhuǎn)移性HSPC患者生存曲線

表2 106例轉(zhuǎn)移性HSPC患者ANXA7蛋白表達(dá)與其PFS的相關(guān)性分析

表3 106例轉(zhuǎn)移性HSPC患者ANXA7蛋白表達(dá)與其OS的相關(guān)性分析

3 討論

前列腺癌由HSPC轉(zhuǎn)變成CRPC 階段是多種機(jī)制共同作用的疾病進(jìn)展過程。涉及信號通路傳導(dǎo)改變，癌基因與抑癌基因調(diào)節(jié)失衡，細(xì)胞因子表達(dá)異常以及雄激素受體（androgen receptor，AR）變異等諸多因素。其中，癌基因的激活和抑癌基因的失活或缺失被普遍認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，許多研究也報道癌基因／抑癌基因的調(diào)節(jié)改變與前列腺癌關(guān)系密切［5］。NOMURA等［6］發(fā)現(xiàn)癌基因Vav3 能 夠提高AR 的活性，加速CRPC 的發(fā)展，沉默Vav3可以抑制AR 的磷酸化，進(jìn)而加強(qiáng)多西他賽促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。KOH等［7］綜述了前人研究認(rèn)為，癌基因MYC在前列腺癌發(fā)生過程中扮演至關(guān)重要的角色，特別是在早期階段，MYC 通過異常激活核糖體合成和細(xì)胞分化過程中的信號通路加速了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。PTEN 是常見的抑癌基因，SIRCAR等［8］研究發(fā)現(xiàn)CRPC患者病理組織中PTEN 表達(dá)缺失高達(dá)77%，而且PTEN 表達(dá)缺失與Akt基因表達(dá)異常以及患者不良預(yù)后有關(guān)。

近年，抑癌基因ANXA7的表達(dá)缺失與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系被逐步揭示［9］。HSU等［10］比較不同分化類型的胃癌組織ANXA7表達(dá)情況，結(jié)果提示ANXA7表達(dá)減少或者缺失大多出現(xiàn)在分化較差的胃癌組織中。JIN等［11］研究發(fā)現(xiàn)ANXA7基因可抑制肝細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，敲除ANXA7基因則淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯增加。YADAV等［12］探索在惡性膠質(zhì)瘤中ANXA7表達(dá)缺失的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ANXA7表達(dá)缺失與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）過表達(dá)有關(guān)，敲除ANXA7基因可使腫瘤細(xì)胞中EGFR 表達(dá)量升高，EGFR 信號通路異常激活。該研究還提示ANXA7低表達(dá)與患者病死率高、生存期 較短有 關(guān)。SONG等［13］研究發(fā) 現(xiàn)ANXA7與galectin－3蛋白相互作用，影響肝細(xì)胞肝癌的生物活性。DONG等［14］觀察到前列腺癌中同樣存在ANXA7的缺失表達(dá)。特別是在局部復(fù)發(fā)的晚期前列腺癌中，ANXA7蛋白表達(dá)相比早期前列腺癌組織顯著缺失。TOROSYAN等［15］則進(jìn)一步研究得出前列腺癌中ANXA7結(jié)構(gòu)改變和功能缺失可能與異常的核糖核蛋白表達(dá)有關(guān)。

為深入分析 HSPC 進(jìn)展為CRPC 過程中ANXA7的作用，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計比較HSPC與CRPC組織、前列腺增生組織中ANXA7蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，ANXA7在前列腺增生組織中全部表達(dá)，而在前列腺癌組織中表達(dá)率明顯下降，不到前者一半。這與以往研究結(jié)論類似，ANXA7表達(dá)減少或缺失與前列腺癌發(fā)生有關(guān)。我們針對HSPC 與CRPC 組織的比較研究發(fā)現(xiàn)伴隨疾病進(jìn)展，ANXA7蛋白的表達(dá)率逐步下降，HSPC 組織中有近五成表達(dá)，而CRPC組織僅有13.6%表達(dá)，且全部屬弱陽性，表達(dá)差異顯著不同。這一結(jié)果初步證實(shí)ANXA7的表達(dá)缺失在前列腺癌疾病進(jìn)展為CRPC階段扮演重要角色。

在ANXA7蛋白表達(dá)與HSPC 患者臨床病理特征及生存期進(jìn)一步的相關(guān)分析中，我們發(fā)現(xiàn)T 分期和N 分期越高，ANXA7 蛋白表達(dá)率越低；Gleason評分越高，ANXA7蛋白表達(dá)率也越低?？紤]到上述臨床病理指標(biāo)一般認(rèn)為是前列腺癌惡性程度高、預(yù)后不佳的危險因素，這一相關(guān)性研究提示ANXA7陰性表達(dá)可能與患者不良預(yù)后有關(guān)。我們進(jìn)一步行ANXA7與患者PFS及OS的生存分析證實(shí)了上述推斷，ANXA7表達(dá)陰性者，其PFS中位值較陽性表達(dá)者少9個月，而OS中位值相比陽性表達(dá)者則明顯減少達(dá)20個月，統(tǒng)計分析認(rèn)為ANXA7表達(dá)缺失是患者不良預(yù)后的預(yù)測因子。

本文在研究中探索抑癌基因ANXA7在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，得到初步的相關(guān)性結(jié)論，但針對ANXA7促進(jìn)前列腺癌疾病進(jìn)展的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探索，以往報道認(rèn)為AR 在疾病進(jìn)展中扮演不可或缺的重要角色，因此有關(guān)其作用機(jī)制的探討還需將ANXA7 放置在AR 信號通路異常激活、AR 突變及上調(diào)改變等相關(guān)方面深入研究。

總之，本研究結(jié)果提示抑癌基因ANXA7蛋白表達(dá)減少可能在轉(zhuǎn)移性前列腺癌疾病進(jìn)展中具有重要作用并與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。盡早進(jìn)行ANXA7表達(dá)檢測有助于判斷患者預(yù)后、指導(dǎo)個體化治療以及為臨床試驗(yàn)提供分組依據(jù)。

［1］GUO C，LIU S，GREENAWAY F，et al.Potential role of annexin A7in cancers［J］.Clin Chim Acta，2013，423：83－89.

［2］TOROSYAN Y，SIMAKOVA O，NAGA S，et al.Annexin－A7 protects normal prostate cells and induces distinct patterns of RB－associated cytotoxicity in androgen－sensitive and－resistant prostate cancer cells［J］.Int J Cancer，2009，125（11）：2528－2539.

［3］HEIDENREICH A，BASTIAN PJ，BELLMUNT J，et al.EAU guidelines on prostate cancer.Part II：Treatment of advanced，relapsing，and castration－resistant prostate cancer［J］.Eur Urol，2014，65（2）：467－79.

［4］MEERA S，LUKAS B，MARK R，et al.Prognostic impact of ANX7－GTPase in metastatic and HER2－negative breast cancer patients［J］.Clin Cancer Res，2004，10（7）：2344－2350.

［5］JU X，ERTELA，CASIMIRO MC，et al.Novel oncogene－induced metastatic prostate cancer cell lines define human prostate cancer progression signatures［J］.Cancer Res，2013，73（2）：978－89.

［6］NOMURA T，YAMASAKI M，HIRAI K，et al.Targeting the Vav3oncogene enhances docetaxel－induced apoptosis through the inhibition of androgen receptor phosphorylation in LNCaP prostate cancer cells under chronic hypoxia［J］.Mol Cancer，2013，12：27－38.

［7］KOH CM，BIEBERICH CJ，DANG CV，et al.MYC and Prostate Cancer［J］.Genes Cancer，2010，1（6）：617－28.

［8］SIRCAR K，YOSHIMOTO M，MONZON FA，et al.PTEN genomic deletion is associated with p－Akt and AR signalling in poorer outcome，hormone refractory prostate cancer［J］.J Pathol，2009，218（4）：505－513.

［9］SRIVASTAVA M，TOROSYAN Y，RAFFELD M，et al.ANXA7expression represents hormone－relevant tumor suppression in different cancers［J］.Int J Cancer，2007，121（12）：2628－2636.

［10］HSU PI，HUANG MS，CHEN HC，et al.The significance of ANXA7expression and its correlation with poor cellular differentiation and enhanced metastatic potential of gastric cancer［J］.J Surg Oncol，2008，97（7）：609－614.

［11］JIN Y，WANG S，CHEN W，et al.Annexin A7suppresses lymph node metastasis of hepatocarcinoma cells in a mouse model［J］.BMC Cancer，2013，13：522.

［12］YADAV AK，RENFROW JJ，SCHOLTENS DM，et al.Monosomy of chromosome 10associated with dysregulation of epidermal growth factor signaling in glioblastomas［J］.JAMA，2009，302（3）：276－289.

［13］SONG L，MAO J，ZHANG J，et al.Annexin A7and its binding protein galectin－3influence mouse hepatocellular carcinoma cell line in vitro［J］.Biomed Pharmacother，2014，68（3）：377－384.

［14］DONG JT.Prevalent mutations in prostate cancer［J］.J Cell Biochem，2006，97（3）：433－447.

［15］TOROSYAN Y，DOBI A，GLASMAN M，et al.Role of multihnRNP nuclear complex in regulation of tumor suppressor ANXA7in prostate cancer cells［J］.Oncogene，2010，29（17）：2457－2466.