王 博，姜曉曉，彭云鵬，莊 巖，孫曉青，朱海濤

（徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇徐州 221002）

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是引發(fā)膀胱出口梗阻（bladder outlet obstruction，BOO）的常見(jiàn)原因，長(zhǎng)期梗阻會(huì)引起進(jìn)行性膠原沉積損害膀胱功能，目前其機(jī)制尚未完全明確。TGF－β1作為已知最強(qiáng)的致纖維化因子，主要通過(guò)經(jīng)典的TGF－β／Smad通路方式介導(dǎo)信號(hào)的胞內(nèi)傳遞。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)TGF－β1在BOO 膀胱組織中表達(dá)增加，推測(cè)BOO 膀胱纖維化的進(jìn)程中亦可能存在TGF－β1相關(guān)的Smads蛋白的表達(dá)。在多種器官纖維化模型的研究中，小劑量紫杉醇因被報(bào)道具有抗炎、抗纖維化的新型作用而受到較多關(guān)注。本文通過(guò)建立大鼠BOO 模型，探討TGF－β1相關(guān)的Smads蛋白在大鼠BOO 膀胱中表達(dá)的變化以及小劑量紫杉醇對(duì)BOO膀胱的可能影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和模型建立 雌性SD 大鼠30 只，SPF級(jí)，體重180～200g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組（10只），BOO 組（10只）和紫杉醇組（10只）。BOO 組與紫杉醇組用20g／L 戊巴比妥鈉（30 mg／kg）腹腔麻醉后固定，消毒。將直徑1mm 硬膜外導(dǎo)管從尿道插入至膀胱，取下腹部正中切口，分離顯露近端尿道，3－0絲線結(jié)扎尿道，結(jié)扎標(biāo)準(zhǔn)以導(dǎo)管移動(dòng)無(wú)阻力且能略帶動(dòng)周?chē)M織移動(dòng)為宜。拔出導(dǎo)管，縫合下腹部切口。空白對(duì)照組在相同部位做相同手術(shù)操作，但不結(jié)扎尿道。在模型建立后，紫杉醇組給予紫杉醇（產(chǎn)品批號(hào)：130103，湖北威爾曼制藥股份有限公司）溶于生理鹽水（0.3mg／kg）后腹腔注射［1］，每周2次?？瞻讓?duì)照組與BOO 組同時(shí)間等體積生理鹽水腹腔注射。各組同條件飼養(yǎng)，自由飲食。4周后，稱(chēng)量體重后處死各組大鼠，取膀胱，去除周?chē)九c結(jié)締組織吸凈水分，稱(chēng)量膀胱重量。

1.2 HE染色 離體膀胱組織于4%中性甲醛中固定48h，進(jìn)行酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟，包埋制成蠟塊。連續(xù)切片，行HE 染色，光鏡下觀察膀胱肌層的增生情況。

1.3 Masson染色 石蠟切片脫蠟水化，蘇木素10 min，流水沖洗5min，復(fù)合染液染色染5min，沖去染液，磷鉬酸1min，沖去后滴加亮綠染液染色10s，水速洗，置于60℃溫箱中烘干，封片。使用Image Pro Plus 6.0軟件分析，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野，以膠原纖維面積／（膠原纖維＋逼尿肌的面積）比值來(lái)反映纖維化的程度，取其平均值作為每例切片的結(jié)果。

1.4 透射電鏡觀察 膀胱離體后立即取1mm3體部組織，2.5%戊二醛（體積分?jǐn)?shù)）中4℃固定，0.1mol／L磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，10g／L 鋨酸溶液固定，雙蒸水洗3遍，依次放入梯度乙醇、90% 無(wú)水丙酮（體積分?jǐn)?shù)）脫水，樹(shù)脂與丙酮混合液（V／V＝1／2）處理樣品2h，樹(shù)脂與丙酮混合液（V／V＝2／1）處理樣品2h，純樹(shù)脂室溫下浸透，然后進(jìn)行包埋及聚合處理，LKBV2088超薄切片機(jī)制作超薄切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛雙染色，H－600型透射電鏡下觀察、照相。鏡下主要觀察成纖維細(xì)胞及膠原纖維數(shù)量的改變。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用SP 法。石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2（體積分?jǐn)?shù)）以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，檸檬酸鹽緩沖液（北京中杉，0.01mol／L pH 6.0）微波修復(fù)抗原，羊血清（北京中杉，SP－9001）封閉，一抗孵育，4℃過(guò)夜。使用生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育10min，辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記鏈霉卵白素37℃孵育10 min，DAB（北京中杉，ZLI－9018）顯色5min，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水反藍(lán)，脫水封片。TGF－β1抗體（SANTA，sc－164）工作濃度為1∶400；p－Smad 2抗體（Bioworld，BS4172）工作濃度為1∶200；α－SMA 抗 體（Bioworld，BS70000）工作濃度為1∶200。以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。雙盲狀態(tài)下，利用Image－Pro Plus6.0圖象分析軟件，校正光密度值后對(duì)每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選5個(gè)視野進(jìn)行平均吸光度分析，用陽(yáng)性染色積分吸光度與肌組織面積的比值作為其平均光密度的值。

1.6 RT－PCR 檢測(cè)取50 mg 冰凍膀 胱組織（－80℃），使用Trizol一步法提取膀胱組織總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定濃度與純度，用2.0μg的mRNA 作為逆轉(zhuǎn)錄模板，以20μL 反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 后放于－20℃保存。然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，總體系為25μL。cDNA 為反應(yīng)的模板，GAPDH 為內(nèi)參。GAPDH（264bp）：上游5－CCTTCATTGACCTCAACTACATG－3；下游5－CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC－3。TGF－β1（437bp）：上 游5′－CCGCAACAACGCAATCTA－3′；下 游5′－TGAGGAGCAGGAAGGGTC－3′。Smad 7（264bp）：上游5′－CTTCCTCCGATGAAACCG－3′；下 游5′－CGCCAT CCACTTCCCTTGT－3′。α－SMA（510bp）：上游5′－CTGAGCGTGGCTATTCCTTC－3′；下游5′－CGTCATACTCCTGTTTGCTGA－3′。

PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10min。每個(gè)樣本重復(fù)反應(yīng)3次。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠成像系統(tǒng)照相，Image J軟件分析結(jié)果。以目的基因條帶與GAPDH 內(nèi)參的灰度值的比值，作為目的基因mRNA 的相對(duì)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，采用單因素方差分析（One－way ANOVA），組間比較使用S－N－K 法，方差不齊時(shí)采用Dennett's方法作多重比較，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠膀胱重量、膀胱重量與體重比的觀察 各組大鼠體重?zé)o明顯的差異（P＞0.05），而在膀胱重量方面，BOO 組明顯高于空白對(duì)照組（P＞0.05），紫杉醇組低于BOO 組（P＞0.05）。BOO 組膀胱重量與體重比值高于空白對(duì)照組（P＞0.05），而紫杉醇組低于BOO 組（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 超微結(jié)構(gòu)改變 空白對(duì)照組肌細(xì)胞間隙狹窄，胞質(zhì)見(jiàn)少量線粒體，形態(tài)完整。BOO 組中平滑肌肥大，細(xì)胞間隙增寬，大量膠原纖維沉積，可見(jiàn)部分類(lèi)似細(xì)胞器碎片散落于間隙。成纖維細(xì)胞中線粒體數(shù)量增加，出現(xiàn)水腫，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多擴(kuò)張。紫杉醇干預(yù)后平滑肌外形略減小，肌間隙減小，間隙中纖維較少沉積。

2.3 HE及Masson染色結(jié)果 空白對(duì)照組逼尿肌肌束排列整齊，胞質(zhì)均勻、胞核清晰。BOO 組逼尿肌肌束肥大，排列紊亂，黏膜下層與肌束之間膠原纖維增多。紫杉醇組與BOO 組比肌增生較弱，數(shù)量略少，肌束間隙略大，膠原纖維顯著減少。平均膠原纖維所占面積比值各組間存在顯著差異。

2.4 超微結(jié)構(gòu)改變 空白對(duì)照組肌細(xì)胞間隙狹窄，胞質(zhì)見(jiàn)少量線粒體，形態(tài)完整。BOO 組中平滑肌肥大，細(xì)胞間隙增寬，大量膠原纖維沉積，可見(jiàn)部分類(lèi)似細(xì)胞器碎片散落于間隙。成纖維細(xì)胞中線粒體數(shù)量增加，出現(xiàn)水腫，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多擴(kuò)張。紫杉醇干預(yù)后平滑肌外形略減小，肌間隙減小，間隙中纖維較少沉積。

表1 大鼠體重、膀胱濕重、膀胱濕重與體重比及膠原纖維占面積百分比的比較 （）

表1 大鼠體重、膀胱濕重、膀胱濕重與體重比及膠原纖維占面積百分比的比較 （）

＊P＜0.05，與空白對(duì)照組比較；#P＜0.05，與BOO 組比較。

2.5 免疫組化結(jié)果 圖像可見(jiàn)TGF－β1呈棕黃色主要在肌細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)，p－Smad 2蛋白呈棕黃色在肌細(xì)胞胞核內(nèi)表達(dá)，α－SMA 主要在平滑肌層表達(dá)。BOO 組和紫杉醇組TGF－β1、p－Smad 2和α－SMA的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；紫杉醇組明顯低于BOO 組（P＜0.05）；空白對(duì)照組幾乎無(wú)表達(dá)或少表達(dá)。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組膀胱組織TGF－β1、p－Smad 2、α－SMA表達(dá)的變化（SP，×400）

表2 各組大鼠膀胱組織TGF－β1、p－Smad 2、α－SMA的平均光密度值的比較 （）

表2 各組大鼠膀胱組織TGF－β1、p－Smad 2、α－SMA的平均光密度值的比較 （）

＊P＜0.05，與空白對(duì)照組比較；#P＜0.05，與BOO 組比較。

2.5 RT－PCR mRNA 檢測(cè)結(jié)果 BOO 組TGF－β1和α－SMA mRNA 表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05）；紫杉醇組中TGF－β1 和α－SMA mRNA 表達(dá)低于BOO 組（P＜0.05），但Smad 7表達(dá)高于BOO組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠膀胱組織TGF－β1、Smad 7、α－SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)情況比較 （）

表3 各組大鼠膀胱組織TGF－β1、Smad 7、α－SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)情況比較 （）

＊P＜0.05，與空白對(duì)照組比較；#P＜0.05，與BOO 組比較。

2.6 相關(guān)性分析 BOO 組大鼠膀胱組織TGF－β1、p－Smad2蛋白表達(dá)與膠原纖維面積比成顯著正相關(guān)（r＝0.892、0.794，P＞0.05）；α－SMA、p－Smad2蛋白的表達(dá)與TGF－β1呈顯著正相關(guān)（r＝0.790、0.874，P＞0.05）。

3 討論

BPH 是多發(fā)于中老年男性的排尿障礙性疾病，為BOO 常見(jiàn)原因之一。長(zhǎng)期梗阻會(huì)引起膀胱結(jié)構(gòu)的不可逆改變［2］，使得即便消除梗阻仍會(huì)有約30%患者難以恢復(fù)正常的膀胱功能。研究表明，BOO 后膠原纖維的沉積是損傷膀胱功能的主要因素［3］。因此對(duì)膀胱纖維化機(jī)制的研究是保護(hù)膀胱功能的重要方向。本實(shí)驗(yàn)中，梗阻后膀胱重量顯著增加（P＞0.05），鏡下可見(jiàn)肌細(xì)胞明顯增生肥大，黏膜下與肌束間膠原纖維明顯增多沉積，這些現(xiàn)象同KITAJIMA［4］等在羊BOO模型中的研究結(jié)果相符。

在各系統(tǒng)纖維化的研究中，TGF－β1被認(rèn)為是最強(qiáng)的致纖維化因子［5］。有報(bào)道指出在BOO 早期，TGF－β1 就已經(jīng) 參與了 膀胱形 態(tài)的變 化［6］。DE ALMEIDA PRADO PS等［7］用阿米替林加重BOO大鼠膀胱纖維化程度后，逼尿肌中TGF－β1的表達(dá)水平顯著增加，可見(jiàn)TGF－β1在膀胱纖維化的進(jìn)程中也有著重要作用，但是TGF－β1激活后，其胞內(nèi)信號(hào)傳遞機(jī)制尚不完全清楚。

目前認(rèn)為Smads蛋白是介導(dǎo)TGF－β1信號(hào)胞內(nèi)傳導(dǎo)的主要中間蛋白，與TGF－β1促進(jìn)纖維化作用密切相關(guān)［8］。近期在炎性膀胱的研究中ISLAM等［9］發(fā)現(xiàn)，TGF－β1可依賴(lài)Smad2／3方式介導(dǎo)膀胱上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過(guò)程，促進(jìn)纖維細(xì)胞合成膠原纖維以利于損傷區(qū)修復(fù)。推測(cè)在膀胱纖維化進(jìn)程中可能同樣存在Smads蛋白的表達(dá)。本研究中，相比空白對(duì)照組，BOO 膀胱中TGF－β1、p－Smad 2和α－SMA 蛋白表達(dá)顯著增加（P＞0.05），相關(guān)分析顯示p－Smad 2與TGF－β1和纖維面積比值均呈顯著正相關(guān)（P＞0.05），提示TGF－β1的增加可促進(jìn)胞內(nèi)信號(hào)蛋白Smad 2的激活，刺激成纖維細(xì)胞膠原的合成，加速纖維化進(jìn)程。此結(jié)果同時(shí)也提示對(duì)TGF－β1／Smad 信號(hào)通路的干預(yù)很可能有延緩BOO 膀胱纖維化的作用。

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）作為抗腫瘤藥物以其高效低毒的優(yōu)點(diǎn)在臨床上長(zhǎng)期使用，近期研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇除在治療劑量下調(diào)控細(xì)胞分裂增殖外，當(dāng)小劑量低頻率使用時(shí)，其還具有能夠安全有效的抑制纖維增生的作用［10］。

動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)損傷組織中局部涂抹紫杉醇（0.4～1.0mg／mL）能減少成纖維及炎細(xì)胞數(shù)量，有抑制瘢痕形成的效果［11］。有學(xué)者在肺纖維化模型中使用紫杉醇后，發(fā)現(xiàn)小劑量紫杉醇能降低TGF－β1 的表達(dá)，減輕上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度［12］。在單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）的研究方面，腹腔注射低劑量紫杉醇（0.3mg／kg，每周兩次）能調(diào)控TGF－β1表達(dá)，抑制Smad 2／3磷酸化，減少膠原生成。在多學(xué)科中已有低劑量紫杉醇抑制膠原沉積的報(bào)道，但其在BOO 后膀胱纖維化中的作用還未見(jiàn)研究。

在本實(shí)驗(yàn)中，低劑量紫杉醇干預(yù)后膀胱組織纖維增生減弱，TGF－β1、Smad 2、α－SMA 表達(dá)減少，抑制型Smad 7表達(dá)升高，進(jìn)一步提示了TGF－β1／Smads信號(hào)通路可能為導(dǎo)致膀胱膠原沉積機(jī)制之一。低劑量紫杉醇可通過(guò)部分下調(diào)TGF－β1／Smads通路蛋白表達(dá)起到延緩膀胱纖維化進(jìn)程的作用。另外，由于TGF－β1／Smads通路的激活本身還受到多種細(xì)胞因子影響以及該藥物的劑量效應(yīng)關(guān)系尚不明了，具體的分子機(jī)制及藥物反應(yīng)作用仍需進(jìn)一步的探索研究獲得。

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