姜華鳳,曹水江,沈 峰,侯 杰,湯 雷,范思祥,仲婷婷,張象威,曹 莉
(1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室,江蘇蘇州 215123;2.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院南京分院普外科,江蘇南京 210015)
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)是四氫吡咯的前綴化合物,是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素 B12等必不可少的物質(zhì)[1]。以往5-ALA作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的新型光活化植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛[2-4]。醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域則大多將5-ALA作為一種新型光動(dòng)力藥物,用于美容及局部或全身的皮膚疾病的治療[5-6]。近年來,有臨床研究報(bào)道,5-ALA 可延緩糖尿病前期病程的發(fā)展,改善糖尿病前期病人的糖耐量[7-8]。我們前期的研究結(jié)果顯示,單獨(dú)用5-ALA對(duì)STZ所致糖尿病小鼠的空腹血糖的影響不明顯。本研究在臨床報(bào)道和前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,觀察5-ALA與二甲雙胍(metformine,Met)聯(lián)合用藥的降血糖作用,并初步探討其機(jī)制。
1.1 藥物與試劑 5-ALA,蘇州益安生物科技有限公司,批號(hào):20130127;鏈脲菌素(STZ):美國Sigma公司,臨用前用0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液(pH 4.4)配成1%的STZ溶液;Met:北京中惠藥業(yè)有限公司;檸檬酸亞鐵(FC):鄭州仁誠化工產(chǎn)品有限公司;葡萄糖氧化酶試劑盒:上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;葡萄糖注射液:中國大冢制藥有限公司。
2.1 小鼠糖尿病模型制備及給藥 小鼠按150 mg·kg-1體重腹腔注射STZ,72 h后測(cè)空腹血糖,血糖值在11.1 mmol·L-1以上的即為糖尿病造模成功小鼠。隨機(jī)為5組,每組10只:模型組、Met組(334 mg·kg-1)、5-ALA 大劑量 +Met組(5-ALA 16.8 mg·kg-1+Met 334 mg·kg-1)、5-ALA 中劑量 +Met組(5-ALA 8.4 mg·kg-1+Met 334 mg·kg-1)、5-ALA 小劑量 +Met組(5-ALA 4.2 mg·kg-1+Met 334 mg·kg-1)。另取10只同批健康小鼠作為正常對(duì)照組。連續(xù)灌胃給藥30 d。
2.2 樣品制備及檢測(cè) 給藥過程中監(jiān)測(cè)基本體征。末次給藥前禁食8h,給藥后30min,眼球后靜脈叢取血,用葡萄糖氧化酶法測(cè)血糖,并留取血漿,用放免法測(cè)胰島素、瘦素(由北京華英生物技術(shù)研究所檢測(cè)),根據(jù)通用方法計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA insulin resistance index,HOMA-IR)、胰島素敏感指數(shù)(HOMA insulin sensitivity index,HOMA-ISI)、β 細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA β-cell function index,HOMA-β)、定量胰島素敏感性檢測(cè)指數(shù)(quantitative insulin sensitivity check index,QUICKI)[9]。
2.3 糖耐量實(shí)驗(yàn) 另取一批小鼠,造模及給藥同“2.1”。末次給藥30 min后,給小鼠灌胃葡萄糖溶液(2 g·kg-1),分別于0、30、60、120 min 取血,檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)血糖值,計(jì)算血糖曲線下面積(area under the curve,AUC),計(jì)算方法:分別為 0、30、60、120 min 血糖值)[10]。
2.4 組織病理學(xué)樣本制備 動(dòng)物放血處死后,取出肝臟、胰腺,10%福爾馬林液固定1個(gè)月,石蠟包埋,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察,拍照。
2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。兩組間比較用方差分析(ONE WAY ANOVA)中的最小明顯差法(LSD)。
3.1 5-ALA和Met對(duì)STZ致糖尿病小鼠基本體征的影響 模型組小鼠毛色枯槁,墊料潮濕,30 d平均體重僅增加1.47 g。給藥各組小鼠毛色均較模型組好,墊料潮濕情況較模型組減輕,平均體重增加均為6 g以上;12 h飲水量較模型組有所減少,添加5-ALA治療組基本體征改善更為明顯,見Tab 1。
Tab 1 Influence of 5-ALA and Met on body weight and water intake in diabetic mice induced by STZ(±s,n=10)
Tab 1 Influence of 5-ALA and Met on body weight and water intake in diabetic mice induced by STZ(±s,n=10)
Group Dose/mg·kg-1 12 h Water Weight/g Before dosing After dosing Δvalue /ml Control - 28.42 ±2.51 48.18±2.97 19.76 4.7 Model - 28.46 ±2.53 29.93±4.47 1.47 26.8 Met 334 28.64 ±2.58 34.91 ±2.28 6.27 22.1 5-ALA+Met 4.2+334 28.81 ±2.07 35.02 ±3.65 6.21 21.4 5-ALA+Met 8.4+334 28.88 ±2.30 35.16 ±3.42 6.28 19.7 5-ALA+Met 16.8+334 28.25 ±2.99 35.21 ±3.22 6.96 18.2
3.2 5-ALA和Met對(duì)STZ致糖尿病小鼠空腹血糖、血漿胰島素、瘦素及胰島素敏感性的影響 如Tab 2所示,給藥各組空腹血糖均較模型組明顯下降(P<0.05),添加5-ALA治療組比單用Met組血糖下降更為明顯,且呈現(xiàn)5-ALA的劑量依賴性,添加5-ALA大、中劑量組與單用Met組比較,差異有顯著性(P<0.05)。
模型組小鼠空腹血漿胰島素和瘦素均較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。Met組血漿胰島素水平較模型組明顯升高(P<0.05);添加5-ALA各治療組血漿胰島素水平與模型組差異無顯著性,而中、大劑量組較單用Met組降低(P<0.05)。除添加小劑量5-ALA組外,各治療組血漿瘦素水平較模型組明顯降低(P<0.05),見 Fig 1、2。
單用Met組小鼠除HOMA-β較模型組明顯增高外,其他胰島素敏感性指標(biāo)與模型組比較差異無顯著性(P>0.05);而添加5-ALA治療組胰島素敏感性指標(biāo)與模型組比較差異均有顯著性(P<0.05),見 Tab 3。
Tab 2 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum glucose in diabetic mice induced by STZ(±s,n=10)
Tab 2 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum glucose in diabetic mice induced by STZ(±s,n=10)
*P <0.05 vs Model;ΔP <0.05 vs Met
Group Dose/mg·kg-1 Glucose/mmol·L -1 Before dosing After dosing Control - 4.17 ±0.50 4.59 ±0.48 Model - 18.69 ±3.26 22.46 ±3.49 Met 334 18.32 ±3.09 16.41 ±3.27*5-ALA+Met 4.2+334 18.46 ±3.81 14.22 ±4.19*5-ALA+Met 8.4+334 18.07 ±3.36 12.07 ±3.06* Δ 5-ALA+Met 16.8+334 18.57 ±3.82 10.94 ±4.21*Δ
Fig 1 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum insulin in diabetic mice induced by STZ(±s,n=10)
Fig 2 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum leptin in diabetic mice induced by STZ(±s,n=10)
3.3 5-ALA和Met對(duì)STZ致糖尿病小鼠糖耐量的影響 給藥各組糖耐量均較模型組明顯改善,添加5-ALA治療組較單用Met組糖耐量改善更為明顯,且呈現(xiàn)明顯的5-ALA劑量依賴性。添加5-ALA大、中劑量組與單用Met比較,曲線下面積AUC明顯減小,見Tab 4。
3.4 5-ALA和Met對(duì)STZ致糖尿病小鼠肝臟及胰腺組織形態(tài)學(xué)影響 模型組小鼠肝臟肝細(xì)胞索排列紊亂,竇間隙消失,肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞可見空泡樣變。給藥各組肝細(xì)胞排列均未見異常,單用Met組和添加5-ALA小劑量組,竇間隙較寬,見Fig 3。
Fig 3 Influence of 5-ALA and Met on liver tissues in diabetic mice induced by STZ
正常組小鼠胰腺中胰腺組織均勻,胰島飽滿,胰島內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞間界限清晰,胞核呈卵圓形,胞質(zhì)均勻飽滿。模型組小鼠胰腺組織疏松,胰島數(shù)量較正常組明顯減少,胰島中細(xì)胞數(shù)量也明顯減少,細(xì)胞間界限不清,細(xì)胞體積縮小,形態(tài)不規(guī)則,胞質(zhì)減少,胞核固縮;單用Met組胰島數(shù)量與模型組相似,但胰島中細(xì)胞胞質(zhì)較模型組飽滿;添加5-ALA各治療組胰島數(shù)量均較模型組和單用Met組明顯增多,胰島中細(xì)胞形態(tài)趨于正常,且呈現(xiàn)出一定的5-ALA劑量依賴性,見Fig 4。
Fig 4 Influence of 5-ALA and Met on pancreas tissues in diabetic mice induced by STZ
5-ALA廣泛分布于各種生物中,通常由琥珀酰CoA與甘氨酸合成,然后脫水縮合生成膽色素原,后者成為血紅素、葉綠素、膽色素、維生素B12等四吡咯化合物生物合成的中間產(chǎn)物,參與氧的運(yùn)輸、生物合成、能量代謝等多種重要的生理過程[11]。臨床上5-ALA作為第2代光敏劑已被廣泛應(yīng)用于各種皮膚病、膀胱癌、尖銳濕疣、上消化道癌、直腸癌、乳腺癌、老年性黃斑變性、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[12]。近年來,除了臨床研究報(bào)道5-ALA可延緩糖尿病前期病程的發(fā)展外,有學(xué)者在研究由于5-ALA脫水酶缺乏而造成的卟啉癥的同時(shí),發(fā)現(xiàn)5-ALA與糖代謝有著密切的關(guān)系[13]。大鼠口服5-ALA可抑制糖異生和糖原分解[14]。
Tab 3Influence of 5-ALA and Met on insulin-sensitivity in diabetic mice induced by STZ(±s,n=10)
Tab 3Influence of 5-ALA and Met on insulin-sensitivity in diabetic mice induced by STZ(±s,n=10)
*P <0.05 vs Model;ΔP <0.05 vs Met
Group Dose/mg·kg-1 Ln(HOMA-IR) Ln(HOMA-ISI) Ln(HOMA-β)0.52 ±0.009 Model - 3.02 ±0.348 -6.13 ±0.348 3.27 ±0.202 0.38 ±0.023 Met 334 2.92 ±0.188 -6.03 ±0.188 3.80 ±0.224* 0.38 ±0.011 5-ALA+Met 4.2+334 2.73 ±0.217 -5.97 ±0.217 3.87 ±0.418* 0.39 ±0.024*5-ALA+Met 8.4+334 2.52 ±0.276*Δ -5.64 ±0.276*Δ 4.00 ±0.421* 0.41 ±0.021*Δ 5-ALA+Met 16.8+334 2.36 ±0.199*Δ -5.24 ±0.199*Δ 4.25 ±0.457*Δ 0.42 ±0.015*Δ QUICKI Control - 1.32 ±0.077 -4.45 ±0.077 6.13 ±0.470
Tab 4Influence of 5-ALA and Met on glucose tolerance in diabetic mice induced by STZ(±s,n=10)
Tab 4Influence of 5-ALA and Met on glucose tolerance in diabetic mice induced by STZ(±s,n=10)
*P <0.05 vs Model;ΔP <0.05 vs Met
Group Dose/mg·kg-1 Glucose/mmol·L -1 0 min 30 min 60 min 120 min AUC/mmol·h·L -1±1.28 21.41 ±3.29 Model - 20.70 ±3.49 23.12 ±2.61 25.94 ±3.87 23.76 ±3.55 71.89 ±9.43 Met 334 15.78 ±2.60* 17.14 ±3.74* 20.55 ±4.07 19.85 ±4.37 55.50 ±10.57*5-ALA+Met 4.2+334 14.57 ±3.94* 16.88 ±3.54* 21.13 ±4.21 17.64 ±4.55* 54.12 ±12.10*5-ALA+Met 8.4+334 11.26 ±3.19*Δ 15.11 ±3.72* 20.01 ±4.32* 16.51 ±4.97* 47.98 ±15.59* Δ 5-ALA+Met 16.8+334 10.49 ±3.71*Δ 11.58 ±4.70*Δ 18.85 ±4.46* 15.87 ±4.79* 42.82 ±13.49*Δ Control - 4.41 ±0.42 7.00 ±1.37 9.53 ±1.78 5.35
本研究根據(jù)國外臨床經(jīng)驗(yàn),在前期研究的基礎(chǔ)上,觀察5-ALA與Met聯(lián)合用藥的降血糖作用。結(jié)果顯示:添加5-ALA的治療組不僅比單用Met組小鼠整體狀態(tài)和糖尿病癥狀改善更為明顯,且其空腹血糖、糖耐量實(shí)驗(yàn)的曲線下面積均明顯降低,血漿胰島素、瘦素水平有所下降,胰島素敏感性改善也更為明顯。添加5-ALA的各治療組胰島數(shù)量均較模型組和單用Met組增多,肝組織和胰島中細(xì)胞形態(tài)趨于正常,且呈現(xiàn)出一定的5-ALA劑量依賴性。盡管有許多研究提出Met可改善胰島素抵抗[15],但其降血糖作用還主要依靠促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素,在增強(qiáng)其代償功能的同時(shí),無疑加重了胰島β細(xì)胞負(fù)擔(dān),所以Met組大鼠在表現(xiàn)出高血漿胰島素水平的同時(shí),胰島β細(xì)胞的形態(tài)并未得到明顯改善。而加用5-ALA的糖尿病大鼠,其機(jī)體胰島素敏感性和瘦素抵抗得到進(jìn)一步改善,相對(duì)減輕了胰島β細(xì)胞負(fù)擔(dān),保護(hù)了胰島的形態(tài)與功能,同時(shí)一定程度上緩解了機(jī)體的高胰島素、高瘦素狀態(tài)。本研究結(jié)果提示:5-ALA可通過提高胰島素敏感性、改善瘦素抵抗及保護(hù)肝臟和胰島的形態(tài)與功能等機(jī)制,明顯增強(qiáng)Met的降血糖、改善糖耐量的作用。
[1]Nishihara E,Kondo K,Parvez M M,et al.Role of 5-aminolevulinic acid(ALA)on active oxygen-scavenging system in NaCltreated spinach(Spinacia oleracea)[J].J Plant Physiol,2003,160(9):1085-91.
[2]Balestrasse K B,Tomaro M L,Batlle A,Noriega G O.The role of 5-aminolevulinic acid in the response to cold stress in soybean plants[J].Phytochemistry,2010,71(17 -18):2038 -45.
[3]Richter A,Peter E,Pors Y,et al.Rapid dark repression of 5-aminolevulinic acid synthesis in green barley leaves[J].Plant Cell Physiol,2010,51(5):670 -81.
[4]Czarnecki O,Hedtke B,Melzer M,et al.An Arabidopsis GluTR binding protein mediates spatial separation of 5-aminolevulinic acid synthesis in chloroplasts[J].Plant Cell,2011,23(12):4476 -91.
[5]Alster T S,Tanzi E L,Welsh E C.Photorejuvenation of facial skin with topical 20%5-aminolevulinic acid and intense pulsed light treatment:a split-face comparison study[J].J Drugs Dermatol,2005,4(1):35 -8.
[6]Mikolajewska P,Donnelly R F,Garland M J,et al.Microneedle pre-treatment of human skin improves 5-aminolevulininc acid(ALA)-and 5-aminolevulinic acid methyl ester(MAL)-induced PpIX production for topical photodynamic therapy without increase in pain or erythema[J].Pharmaceut Res,2010,27(10):2213 -20.
[7]Rodriguez B L,Curb J D,Davis J,et al.Use of the dietary supplement 5-aminiolevulinic acid(5-ALA)and its relationship with glucose levels and hemoglobin A1C among individuals with prediabetes[J].Clin Transl Sci,2012,5(4):314 - 20.
[8]Higashikawa F,Noda M,Awaya T,et al.5-aminolevulinic acid,a precursor of heme,reduces both fasting and postprandial glucose levels in mildly hyperglycemic subjects[J].Nutrition,2013,29(7-8):1030-6.
[9]Cao L,Mao C,Li S,et al.Hepatic insulin signaling changes:possible mechanism in prenatal hypoxia-increased susceptibility of fatty liver in adulthood[J].Endocrinology,2012,153(10):4955-65.
[10]曹 莉,茅彩萍,顧振綸.葛根素對(duì)高脂飲食大鼠胰島素敏感性的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2007,23(12):1598-601.
[10]Cao L,Mao C P,Gu Z L.The effect of Puerarin on insulin sensitivity of the rats fed with high fat diet[J].Chin Pharmacol Bull,2007,23(12):1598 -601.
[11]Ano A,F(xiàn)unahashi H,Nakao K,Nishizawa Y.Effect of glycine on 5-aminolevulinic acid biosynthesis in heterotrophic culture of Chlorella regularis YA-603[J].J Biosci Bioengin,1999,88(1):57 -60.
[12]Yang G,Xiang L F,Gold M H.5-Aminolevulinic acid-based photodynamic intense pulsed light therapy shows better effects in the treatment of skin photoaging in asian skin:a prospective,singleblinded,controlled trial[J].J Clin Aesthet Dermatol,2010,3(3):40-3.
[13]Gross U,Sassa S,Jacob K,et al.5-Aminolevulinic acid dehydratase deficiency porphyria:a twenty-year clinical and biochemical follow-up[J].Clin Chem,1998,44(9):1892 -6.
[14]Matkovic L B,D'Andrea F,F(xiàn)ornes D,et al.How porphyrinogenic drugs modeling acute porphyria impair the hormonal status that regulates glucose metabolism.Their relevance in the onset of this disease[J].Toxicology,2011,290(1):22 -30.
[15]陳 梅,劉潤(rùn)俠.二甲雙胍對(duì)多囊卵巢綜合征模型大鼠血清抑制素B、激活素A、卵泡抑素水平的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2009,25(10):1370 -3.
[15]Chen M,Liu R X.The effect of metformin on inhibin B,activin A and follistatin of polycystic ovary syndrome rats[J].Chin Pharmacol Bull,2009,25(10):1370 -3.