易 嵐，伍尤華，譚 暉，何 潔，李林蔚，單 健，蘇 琦

(南華大學(xué)1.腫瘤研究所、2.藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院、3.附屬第一醫(yī)院腫瘤科，湖南 衡陽 421001)

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為治療腫瘤的新方法之一［1］。研究表明［2］，眾多的細(xì)胞因子和藥物具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。其中，大蒜及其烯丙基硫化物的抗癌作用正日益受到關(guān)注。研究顯示，二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)，大蒜主要有效成分之一，可誘導(dǎo)胃癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞凋亡［3］。我們前期工作已經(jīng)證實(shí)，DADS不僅可誘導(dǎo)人結(jié)腸癌等細(xì)胞分化與凋亡，而且可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞分化與凋亡［4］。DADS對(duì)人白血病細(xì)胞具有雙效作用，小劑量DADS(＜1.25 mg·L－1)誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞分化，其機(jī)制與抑制JAK1/STAT3的酪氨酸激酶活性、下調(diào)STAT3與Myc核內(nèi)表達(dá)水平，提高組蛋白乙?；郊皃21WAF1表達(dá)上調(diào)有關(guān)［5］。而中等劑量 DADS(＞1.25 mg·L－1)可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與G2/M期阻滯，活性氧，抑制 ERK 和激活 p38，下調(diào) Bag-1、Bcl-2，上調(diào)Fas-L、Bax 等有關(guān)［6－7］。但具體機(jī)制尚不清楚。

在前期工作的基礎(chǔ)上，我們應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出7個(gè)與DADS誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡的相關(guān)的差異蛋白，其中Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2(Rac2)表達(dá)明顯上調(diào)［8］，Rac2 是 NADPH氧化酶的6個(gè)亞基之一，是NADPH氧化酶活化必不可少的。NADPH氧化酶的激活受高度調(diào)控，在此過程中，Rac2與 p67phox相互作用起著關(guān)鍵作用［9］。NADPH氧化酶是誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS的主要來源之一，而ROS可觸發(fā)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起細(xì)胞凋亡。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，研究DADS活化NADPH氧化酶，通過活性氧途徑誘導(dǎo)人白血病K562細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步闡明白血病的發(fā)病機(jī)制，為白血病的誘導(dǎo)凋亡治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 DADS為Fluka公司產(chǎn)品，小牛血清是杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品。BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品。RNA抽提試劑盒Ⅱ?yàn)镺mega公司產(chǎn)品，TRIzol試劑為Invitrogen Life Technologies產(chǎn)品。免疫共沉淀試劑盒為Santa Cruz公司產(chǎn)品。2'，7'-二氯氫化熒光素二脂(DCFHDA)、phorbol myristate acetate(PMA)、diphenyleneiodonium(DPI)、Rac2、p67phox等試劑為 Santa Cruz公司產(chǎn)品。二抗為Abcam Biotechnology公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)采用常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的RPMI 1640，在37℃，飽和濕度，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3～4 d換液傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，DADS用培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.2.2 MTT檢測 用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積100 μl，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加入處理因素并設(shè)0對(duì)照、空白對(duì)照、溶酶對(duì)照和不同濃度DADS處理組。在37℃，飽和濕度，5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。于結(jié)束前4 h除對(duì)照組外，每孔加 MTT溶液(5 g·L－1用 PBS配制，pH=7.4)20 μl，繼續(xù)孵育 4 h，終止培養(yǎng)。離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，充分融解結(jié)晶物。酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔吸光度，檢測波長570 nm，按下列公式計(jì)算抑制率(IR%)。

1.2.3 Real-time PCR引物合成 利用 Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，送交寶生物工程大連有限公司合成。實(shí)時(shí)定量PCR使用的管家基金(β-actin)以及NADPH氧化酶的6個(gè)亞基引物分別為如下所示。β-actin正義引物序列為5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3'，反義引物序列為:5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3'，產(chǎn)物長度為211bp;NCF2正義引物序列為:5'-GAAGAAGGGCAATGATAACTGG-3'，反義引物序列為:5'-TAGGAGGAGCTGGGATGTCG-3'，產(chǎn)物長度為155bp;RAC2正義引物序列為:5'-TCATCTGCTTCTCCCTCGT-3'，反義引物序列為:5'-GATGGTGTCCTTGTCGTCC-3'，產(chǎn)物長度為143bp;CYBB正義引物序列為:5'-CAAGATGCGTGGAAACTACCT-3'，反義引物序列為:5'-TGACTTGAGAATGGATGCGAA-3'，產(chǎn)物長度為138bp;CYBA正義引物序列為:5'-ATTGTGGCGGGCGTGTTT-3'，反義引物序列為:5'-CACGGCGGTCATGTACTTCTGT-3'，產(chǎn)物長度為 102bp;NCF1正義序列為:5'-ACCCTGAGCCCAACTATGC-3'，反義序列為:5'-GGACGGGAAGTAGCCTGTG-3'，產(chǎn)物長度為170bp;NCF4正義引物序列為:5'-CAGCCTGATGCCTCCTTACTC-3'，反義引物序列為:5'-TCTGGAACTCCCGCCTTGT-3'，產(chǎn)物長度為120bp。按照Total RNA KitⅡ說明書提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定RNA的純度和濃度。cDNA合成:將2 μg的總RNA 72℃ 10 min預(yù)變性，冰上冷卻3 min后，按RT試劑盒說明書依次加入各試劑，建立一個(gè)總反應(yīng)體積20 μl的體系，42℃90 min，冰上冷卻2 min，－20℃保存?zhèn)溆谩ealtime PCR擴(kuò)增:將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到Real-time PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增和檢測。幾個(gè)梯度稀釋的DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置總體積為25 μl反應(yīng)體系，置于Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對(duì)含量。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測 收集細(xì)胞，用Hanks液洗滌細(xì)胞 2 次，加入終濃度為 10 μmol·L－1的DCFH-DA 400 μl，充分混勻，在37℃條件下避光反應(yīng)50 min，用Hanks液洗滌細(xì)胞3次以去除細(xì)胞外熒光劑，用500 μl Hank's液重懸細(xì)胞，37℃條件下水浴10 min，流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

1.2.5 Western blot檢測 細(xì)胞裂解:分別收集各組細(xì)胞，冰PBS洗兩次，每1×107個(gè)細(xì)胞濃度加入100 ～150 μl裂解液(100 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.6，1 mmol·L－1EDTA pH 8.0，1 mg·L－1Aprotinin，100 mg·L－1PMSF)，冰上裂解1 h，4℃，12 000 r·min－1離心 10 min，上清液即為細(xì)胞總蛋白。根據(jù)Bradford法進(jìn)行蛋白含量的測定。蛋白變性后經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCL 20 mmol·L－1，NaCl 137 mmol·L－1含0.1%Tween-20)封閉1 h，用特異性一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，相應(yīng)的二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑檢測蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.2.6 免疫共沉淀 按照Seize Classic Mammalian Immunoprecipitation試劑盒說明書進(jìn)行，將得到抗體復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再進(jìn)行Western blot檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，Student't-test法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，數(shù)值用±s表示，用Sigma Plot10.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測DADS對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用 如 Tab 1 所示，2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L－1DADS處理人白血病K562細(xì)胞，抑制率分別為32.48%、59.34%、66.42%、81.05%、87.09%，抑制率呈濃度依賴性增加(P＜0.05)。Tween80對(duì)照組對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制作用(P＞0.05)。這些結(jié)果表明，DADS以劑量依賴性抑制K562細(xì)胞的生長。IC50值在 5.0 mg·L－1左右。

Tab 1 OD570value of different concentrations of DADS treated K562 cells for 48 hours

2.2 DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中 NADPH氧化酶各亞基mRNA表達(dá)水平 Real-time PCR結(jié)果如Fig 1所示，6 mg·L－1DADS作用K562細(xì)胞6 h后，NADPH氧化酶復(fù)合物的6個(gè)亞基(包括CYBA、CYBB、NCF1、NCF2、NCF4 和 RAC2)相對(duì)定量的值分別為1.31×10－3±1.1×10－4、9.85 ×10－4±2.3 ×10－5、1.01 ×10－3±1.1 ×10－4、3.94 ×10－5±3.3 ×10－6、1.65 ×10－3±2.1 ×10－4、1.48 ×10－3±1.8×10－4，較處理前的 1.08 ×10－3±1.3×10－4、4.03×10－4±1.1×10－5、2.57 ×10－4±2.0 ×10－5、1.67×10－5±2.5 ×10－6、1.22 ×10－3±1.2 ×10－4、1.04×10－3±1.4 ×10－4，NADPH 氧化酶各亞基mRNA水平都明顯上調(diào)(P＜0.05)。

Fig 1 Real-time PCR analysis of mRNA levels of components of the NADPH oxidase in K562 cells treatedby 6 mg·L －1DADS for 6 hours

2.3 Rac2在DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中表達(dá)上調(diào) Rac2對(duì)NADPH氧化酶(NADPH oxidase)的6個(gè)亞基之一，Rac2是NADPH氧化酶活化是必不可少的。Western blot分析結(jié)果如Fig 2所示，與對(duì)照組相比，5.0、10.0 mg·L－1DADS 作用 K562 細(xì)胞24 h后，蛋白 Rac2的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05)。

Fig 2 Western blot analysis of expression of Rac2 in K562 cellsinduced by different concentrations of DADS

2.4 免疫共沉淀檢測NADPH氧化酶亞基Rac2與p67phox結(jié)合 免疫共沉淀結(jié)果如Fig 3所示，通過用Anti-Rac2沉淀K562細(xì)胞的裂解蛋白，Western blot檢測到 p67phox存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在DADS誘導(dǎo)的 K562細(xì)胞凋亡過程中，有 Rac2和p67phox的結(jié)合，即存在NADPH氧化酶的活化。

Fig 3 Western blot analysis p67phox in K562 cells after subsided by Anti-Rac2

2.5 NADPH氧化酶激活劑和抑制劑對(duì)DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的影響 我們采用NADPH氧化酶的激活劑PMA和NADPH氧化酶的黃素蛋白抑制劑DPI來進(jìn)一步研究NADPH氧化酶對(duì)DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的影響。

流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞百分率結(jié)果如Fig 4所示，PMA單獨(dú)作用K562細(xì)胞24 h，其凋亡細(xì)胞百分率為(10.2±1.04)%，PMA與6 mg·L－1DADS聯(lián)合處理K562細(xì)胞24 h，凋亡細(xì)胞百分率為(40.5±2.03)%，與 DADS單獨(dú)處理組(30.9% ±1.34)%相比，PMA能明顯提高DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用 (P＜0.05)，DPI單獨(dú)作用K562細(xì)胞24 h，凋亡細(xì)胞百分率為(3.35±0.76)%，可見，DPI并未能誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。DPI與6 mg·L－1DADS聯(lián)合處理K562細(xì)胞24 h，凋亡細(xì)胞百分率為(17.3±1.03)%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DPI能抑制DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。

2.6 NADPH氧化酶的活化是DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞活性氧主要來源 流式細(xì)胞術(shù)檢測DCF的熒光強(qiáng)度結(jié)果如Fig 5所示，對(duì)照組、6 mg·L－1DADS處理K562細(xì)胞8 h組、PMA單獨(dú)處理組、DADS和PMA聯(lián)合處理組、DPI單獨(dú)處理組、DADS和DPI聯(lián)合處理組，流式細(xì)胞術(shù)檢測DCF的熒光強(qiáng)度分別為10.2±0.98、33.0±1.65、30.5±1.73、43.7±1.76、10.0±0.98、11.8 ±0.95，可見，PMA 能提高DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞活性氧的水平(P＜0.05)，而DPI明顯抑制了DADS作用的K562細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生(P＜0.05)。

3 討論

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為治療腫瘤的一種新的可能性［10］。眾多的細(xì)胞因子和藥物都能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其中，大蒜及其烯丙基硫化物的抗腫瘤作用已日益引起人們的關(guān)注。DADS作為大蒜提取物中最有效的成分，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞包括人慢性髓細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞系凋亡，但是其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。我們前期工作已經(jīng)表明，低劑量(＜1.25 mg·L－1)的DADS具有抗增殖作用，能誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化［11］。本研究用中等濃度(2.5～20 mg·L－1)DADS來誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。在我們前期工作的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步證實(shí)了DADS對(duì)K562細(xì)胞的生長抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DADS以劑量依賴方式抑制K562細(xì)胞的活性。

本研究 Real-time PCR結(jié)果顯示，6 mg·L－1DADS作用K562細(xì)胞6h后，NADPH氧化酶復(fù)合物的6 個(gè)亞基(包括 CYBA、CYBB、NCF1、NCF2、NCF4和RAC2)的mRNA水平都明顯上調(diào)(P＜0.05)。Rac2是NADPH氧化酶(NADPH oxidase)的6個(gè)亞基之一，Rac2的活化是NADPH氧化酶活化是必不可少的。Western blot分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，5.0、10.0 mg·L－1DADS 作用人白血病 K562 細(xì)胞24 h后蛋白 Rac2的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05)。這些研究結(jié)果表明DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的過程中有NADPH氧化酶的活化。

有研究表明，NADPH氧化酶有6個(gè)亞基，在NADPH氧化酶活化過程中，Rac2與p67phox結(jié)合是NADPH氧化酶的活化非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)［12］。因此我們應(yīng)用免疫共沉淀方法來檢測DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的過程中Rac2與p67phox是否結(jié)合，進(jìn)一步研究在DADS誘導(dǎo)人白血病K562細(xì)胞凋亡過程中，是否有NADPH氧化酶的活化。免疫共沉淀結(jié)果顯示，通過用Anti-Rac2沉淀K562細(xì)胞的裂解蛋白，Westernblot檢測到p67phox存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在DADS誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡過程中，有Rac2和p67phox的結(jié)合，也進(jìn)一步說明有NADPH氧化酶的活化。

Fig 4 Flow cytometry analysis of percentage of apoptosis cells in K562 cells

Fig 5 Flow cytometry analysis DCF fluorescence intensities of K562 cells

為進(jìn)一步研究NADPH氧化酶與DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的關(guān)系，我們采用NADPH氧化酶的激活劑PMA和NADPH氧化酶的黃素蛋白抑制劑DPI來研究NADPH氧化酶對(duì)DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞百分率結(jié)果顯示，PMA與DADS聯(lián)合處理組凋亡細(xì)胞百分率明顯高于與DADS單獨(dú)處理組，而DPI與DADS聯(lián)合處理組凋亡細(xì)胞百分率為明顯低于DADS單獨(dú)處理組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PMA能明顯提高DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用，而DPI能抑制DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡?？梢?，NADPH氧化酶與DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

研究表明，DADS能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，產(chǎn)生的活性氧和腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步的命運(yùn)包括凋亡密切相關(guān)［13－14］。我們的前期研究結(jié)果顯示，DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中活性氧水平明顯提高［7］。但是活性氧有多種來源，這些活性氧的來源并不確定，NADPH氧化酶的活化是活性氧的一個(gè)重要來源之一［15］。盡管我們的研究已經(jīng)表明，在DADS誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡的過程既有NADPH氧化酶的活化，又有活性氧的產(chǎn)生，但是NADPH氧化酶的活化是不是活性氧的主要來源還有待于進(jìn)一步研究。因此我們用PMA及DPI預(yù)處理細(xì)胞，以便檢測DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中活性氧的水平，以確定NADPH氧化酶的活化是否DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中活性氧主要來源。流式細(xì)胞術(shù)檢測DCF的熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示，PMA明顯提高了DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞活性氧的水平，而DPI預(yù)處理的細(xì)胞卻沒有活性氧的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，NADPH氧化酶是DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中活性氧的主要來源。

NADPH氧化酶在多種腫瘤組織中的表達(dá)異于組織來源相同的正常組織，其催化產(chǎn)生的活性氧，可以誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和血管生成等等，這些為研究腫瘤發(fā)生和治療提供了新的思路。本研究結(jié)果不僅表明DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的過程中有NADPH氧化酶的活化，而且證實(shí)了NADPH氧化酶的活化是DADS誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中活性氧產(chǎn)生的主要來源。因此，NADPH氧化酶的活化在DADS誘導(dǎo)人白血病K562細(xì)胞凋亡中起著重要作用。當(dāng)然，DADS誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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