吳海璇，馮璐璐，徐 輝，賀秋蘭，李梅娜，魏 明，孫來保，鄒學(xué)農(nóng)

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.麻醉科、2.骨科，廣東廣州 510080;3.中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510120)

椎間盤突出導(dǎo)致的腰腿痛是一種常見病，造成了巨大的社會負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的非手術(shù)治療方法，如硬膜外腔注射糖皮質(zhì)激素和局麻藥雖可在短期內(nèi)一定程度上緩解疼痛，但其長期療效遭到質(zhì)疑［1］。蛇床子素又名甲氧基歐芹酚(osthol，Ost)，是從傘形科植物蛇床成熟果實(shí)蛇床子(Fructus Cnidii)中提取的香豆素類化合物。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有多種生物學(xué)活性，如抗心律失常、抗氧化、抗炎、抗過敏、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤及抗細(xì)胞凋亡等［2－3］。其中，抗炎鎮(zhèn)痛作用尤為突出［4］。當(dāng)前研究表明炎癥因素在盤源性腰腿痛(discogenic low back pain，DLBP)的發(fā)病中扮演著不容忽視的重要作用［5］。蛇床子素抗炎作用明顯，能從多個環(huán)節(jié)作用于DLBP的形成和發(fā)展過程，研究并闡明其在治療DLBP中的價值和具體作用機(jī)制對于開發(fā)新的治療藥物具有重要意義。本課題組在前期研究中已發(fā)現(xiàn)硬膜外腔注射蛇床子素的鎮(zhèn)痛作用與抑制L4－6背根神經(jīng)節(jié)中環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)［6］、一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)［7］、酸敏感性離子通道3(acid-sensing ion channel 3，ASIC3)［8］和降鈣素基因相關(guān)肽受體1(calcitonin gene-related peptide receptor 1，CGRPR1)的表達(dá)有關(guān)，但蛇床子素在脊髓水平的鎮(zhèn)痛機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。脊髓背角細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要通路之一，在接受傷害性信號刺激后靜息態(tài)的ERK可被激活為磷酸化ERK(pERK)，從而啟動下游一系列的適應(yīng)性反應(yīng)，將傷害性信號傳入胞內(nèi)。因此，本研究通過探討硬膜外注射蛇床子素對大鼠腰段脊髓背角ERK通路及對該通路所調(diào)控的基因表達(dá)的影響，初步闡明蛇床子素在脊髓水平的鎮(zhèn)痛機(jī)制，為蛇床子素的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級成年♂ SD大鼠125只，體質(zhì)量250～300 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號:SCXK(粵)2008－0002。分籠飼養(yǎng)，室溫(23±2)℃，維持大鼠12/12晝夜節(jié)律(每日8∶00～20∶00光照)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守中山大學(xué)動物保護(hù)和使用規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器 蛇床子素(110822-200407，廣州市藥品檢驗(yàn)所)用二甲亞砜(DMSO，Sigma，USA)溶解;兔抗鼠 pERK一抗(4370S，Cell Signaling，USA);兔抗鼠 ERK 一抗(BS1112，Bioworld technology，USA);羊抗兔生物素化二抗(BA1003，武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒(AR1022，武漢博士德生物工程有限公司);TRlzol Reagent(15596－026，Invitrogen公司);Taq DNA 聚合酶(DR001A，TaKaRa公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和dNTPs購自 Qiagen公司;Frey纖毛儀(Stoelting公司，USA);CFX96熒光定量 PCR儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.3 動物模型建立、分組及處理

1.3.1 動物模型建立 參照文獻(xiàn)［7］建立動物模型，10%水合氯醛麻醉大鼠(3.5 ml·kg－1，ip.)，以髂嵴最高點(diǎn)連線為中心做3 cm左右正中切口，切除左側(cè)L5下關(guān)節(jié)突、L6上關(guān)節(jié)突和L5半椎板，暴露左側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)。取鼠尾近段根部自體髓核(約0.4 mg)，置于L5背根神經(jīng)節(jié)上。將PE-10導(dǎo)管向頭側(cè)硬膜外腔輕柔置入約4 mm，另一端從頸后引出封管。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，用2%利多卡因10 μl判斷導(dǎo)管位置(注射30 s內(nèi)出現(xiàn)雙后肢麻痹說明導(dǎo)管位置正確)。Sham組取尾部自體髓核組織，但不將其置于暴露部位，余操作同上。

1.3.2 動物分組及處理 成年♂ SD大鼠125只，隨機(jī)分為5組，每組25只，分別為 Blank組、Sham組、NP組、Ost組、Vehicle組，其中Ost組于術(shù)后d 6于硬膜外腔給予 82 mmol·L－1蛇床子素 50 μl，即 1 mg·rat－1蛇床子素，Vehicle組給予 10%DMSO 50 μl。各組大鼠分別于術(shù)前 1 d，術(shù)后 3、6、7、10、14、21 d測定50%機(jī)械痛縮足閾值(50%mechanical withdrawal threshold，50%MWT)，在術(shù)后 14 d 測定機(jī)械痛閾后，每組隨機(jī)取15只大鼠，取術(shù)側(cè)腰段脊髓背角，Western blot法檢測ERK、pERK蛋白的表達(dá)，熒光定量PCR法檢測COX-2 mRNA的表達(dá)。

1.4 50%機(jī)械痛縮足閾值 (50%mechanical withdrawal threshold，50%MWT)在制模前，將 SD大鼠每日9∶00～16∶00放于有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)環(huán)境，并測定術(shù)前1 d的基礎(chǔ)值。術(shù)后的行為學(xué)測試時間定于9∶00～16∶00進(jìn)行，測試前所有大鼠均在玻璃箱中適應(yīng)30 min，待安靜后進(jìn)行測試。根據(jù)Chaplan等［9］報道的方法稍加改進(jìn)，檢測50%MWT:大鼠置于透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)自由活動，安靜后以不同折力的von Frey纖毛刺激大鼠足底，避開肉墊使之稍成S形，持續(xù)6～8 s。大鼠后肢迅速畏縮、撤回，認(rèn)為是陽性反應(yīng)。從2 g開始，當(dāng)該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級力度的刺激;如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級力度的刺激，如此連續(xù)進(jìn)行，每個強(qiáng)度反復(fù)刺激5次，將出現(xiàn)3次以上陽性反應(yīng)的最小von Frey纖維強(qiáng)度定為大鼠的50%MWT。兩次刺激之間至少間隔約15 s。

1.5 Western blot檢測脊髓背角神經(jīng)元中ERK1/2和pERK1/2蛋白表達(dá)水平 大鼠深麻醉后，在冰面上迅速取出術(shù)側(cè)腰段脊髓背角，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中(50 mmol·L－1Tris HCl(pH 7.5)，5 mmol·L－1EDTA，150 mmol·L－1NaCl，10 ml·L－1Triton X-100)，超聲勻漿、水浴、高速離心后取上清。每次電泳前各組樣品隨機(jī)取一管上樣測蛋白濃度，以SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用脫脂牛奶封閉2 h后，在4℃條件下與ERK或pERK一抗(1∶1 000)或抗GAPDH(1∶1 000)共孵育48 h，再與二抗(1∶2 500)室溫下孵育2 h。將膜與ECL試劑反應(yīng)后依次壓片、顯影、定影，用Image J 6.0軟件采集膠片條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將每次實(shí)驗(yàn)中各樣品灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值相除作為ERK或pERK蛋白相對含量。

1.6 熒光定量RT-PCR法檢測COX-2表達(dá)水平取脊髓背角組織，按TRIzol抽提法提取總RNA，紫外吸收測定法檢測RNA濃度和純度。取適量RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，－20℃保存待用。采用Primer5.0設(shè)計基因特異性引物。COX-2引物序列:5'-CTGAGGGGTTACCACTTCCA-3'(上游)，5'-TGAGCAAGTCCGTGTTCAAG-3'(下游);內(nèi)參 β-actin引物序列:5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'(上游)，5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'(下游)，上述引物均由上海生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系:SYBR Green 1 染料 10 μl，上游引物1 μl，下游引物 1 μl，dNTP 1 μl，Taq 聚合酶 2 μl，待測樣品 cDNA 5 μl，雙蒸水 30 μl。PCR 體系反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃4 min，變性94℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃ 30 s，共30個循環(huán)，終延伸72℃ 7 min。實(shí)時分析軟件計算每個標(biāo)本的循環(huán)閾值(Ct值)，運(yùn)用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，且采用 2－ΔΔCt法來計算。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。用Levene法檢測各組樣本方差是否齊性。方差齊性時，術(shù)后同組間不同時間點(diǎn)的50%MWT比較采用重復(fù)測量設(shè)計的Friedman ANOVA方差分析，術(shù)后同一時間點(diǎn)不同組間的50%MWT、ERK及pERK相對蛋白濃度和COX-2 mRNA含量比較采用One-way ANOVA方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義時用LSD法行兩兩比較;方差不齊時，同組間50%MWT比較采用多因素方差分析，組間比較采用Kruskal-Walllis秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用Dunnett T3檢驗(yàn)，P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。pERK和COX-2 mRNA的相關(guān)性分析采用Speraman秩相關(guān)分析法，P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠硬膜外腔給藥前后50%MWT的變化 各組大鼠術(shù)前的50%MWT比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與Blank組相比，Sham組僅在術(shù)后d 1 50%MWT降低有統(tǒng)計學(xué)意義，后逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平，而NP組、Vehicle組和Ost組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)術(shù)側(cè)后肢50%MWT值明顯降低(P＜0.05)，其中NP組和Vehicle組的痛閾降低一直持續(xù)至術(shù)后21 d。術(shù)后d 6，Vehicle組和Ost組分別于硬膜外腔給予相應(yīng)藥物，在給藥后各時間點(diǎn)，與Vehicle組相比，Ost組50%MWT明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

Fig 1 Comparison of 50%MWT before and after epidural application of drug in different groups of rats

2.2 術(shù)后d 13各組大鼠脊髓背角ERK表達(dá)的變化 硬膜外腔給藥后8 d，即術(shù)后d 14，各組大鼠脊髓背角ERK的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見Fig 2。

2.3 術(shù)后d 14各組大鼠脊髓背角pERK1/2蛋白表達(dá)的變化 術(shù)后d 14，Blank組和Sham組大鼠脊髓背角pERK1/2表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，NP、Ost和Vehicle組較Blank組表達(dá)增高(P＜0.05)。與 Vehicle組相比，Ost組的 pERK1和pERK2表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)，NP組的pERK1和pERK2表達(dá)水平均較Vehicle組高(P＜0.05)。見Fig 3。

Fig 2 Expression and relative concentration of ERK1/2 in different groups of rats on postoperative d14 after surgery

Fig 3 Expression and relative concentration of pERK1/2 in different groups of rats on postoperative day 14

2.4 術(shù)后d 14各組大鼠脊髓背角COX-2 mRNA表達(dá)的變化 硬膜外腔給藥后8 d，即術(shù)后d 14，Sham組和Blank組脊髓背角細(xì)胞中COX-2 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與Blank組相比，NP組和Vehicle組COX-2 mRNA表達(dá)均明顯增高(P＜0.01)，Ost組 COX-2 mRNA表達(dá)略增加(P＜0.05)。與 Vehicle組相比，Ost組 COX-2 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Relative expression of COX-2 mRNA in spinal dorsal horn of different groups of rats on postoperative day 13

2.5 各組大鼠脊髓背角pERK1/2與COX-2mRNA的相關(guān)性分析 對各組大鼠脊髓背角pERK與COX-2 mRNA行Spearman秩相關(guān)分析，pERK1和COX-2 mRNA秩相關(guān)系數(shù)r=0.878(P＜0.01)，pERK2和COX-2 mRNA秩相關(guān)系數(shù)r=0.910(P＜0.01)，表明各組大鼠脊髓背角pERK1/2與COX-2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)。

3 討論

3.1 蛇床子素對ERK通路的影響 炎癥導(dǎo)致的周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)敏感性改變是引起痛覺過敏的主要原因。在脊髓水平，痛覺過敏的神經(jīng)生理學(xué)改變主要表現(xiàn)為異位電活動增多、痛覺傳遞信號通路的持續(xù)激活以及突觸傳遞效能的增強(qiáng)，這些神經(jīng)元的可塑性變化構(gòu)成神經(jīng)根炎癥時產(chǎn)生的痛覺過敏、觸誘發(fā)痛以及痛輻射等疼痛癥候群行為表現(xiàn)的基礎(chǔ)［10］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)最主要的共同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，其中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是 MAPK家族的重要成員。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號通路作為一條將細(xì)胞外信息向細(xì)胞核傳遞的通路，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞的增殖和凋亡中均起著重要的調(diào)節(jié)作用。既往關(guān)于蛇床子素對于ERK通路的作用主要集中在神經(jīng)保護(hù)［11］、細(xì)胞分化和抗骨質(zhì)疏松等方面。本課題組在前期試驗(yàn)中已證實(shí)DRG暴露于髓核后，術(shù)后d 1脊髓背角淺層pERK蛋白的表達(dá)即明顯上調(diào)，至少持續(xù)至術(shù)后21 d，與疼痛行為學(xué)改變相一致。且該炎性痛敏能被ERK通路拮抗劑所緩解，并伴有背角pERK表達(dá)減少，說明ERK信號通路參與髓核導(dǎo)致的神經(jīng)根炎性痛。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，于術(shù)后d 6硬膜外腔單次注射蛇床子素治療髓核致炎大鼠的已形成了的神經(jīng)根炎性痛，獲得了確切、長期(21 d)有效的疼痛緩解效果，并伴有腰段脊髓背角pERK蛋白表達(dá)明顯減少。我們的研究結(jié)果表明抑制脊髓背角pERK通路很可能是蛇床子素鎮(zhèn)痛作用的重要機(jī)制之一。

3.2 ERK信號通路通過調(diào)控COX-2基因表達(dá)介導(dǎo)痛敏 傷害性刺激會使脊髓背角神經(jīng)元的ERK發(fā)生磷酸化，磷酸化的ERK能從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，激活相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而啟動基因轉(zhuǎn)錄，因此ERK通路可通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致痛覺過敏。研究表明［12］，pERK調(diào)控的下游靶基因主要有 COX-2、CGRP、NK-1、強(qiáng)啡肽、內(nèi)啡肽等。其中，COX-2是以花生四烯酸(AA)為底物生成前列腺素(PGs)過程中的限速酶。而前列腺素，尤其是前列腺素E2(PGE2)，作為重要的炎癥和促傷害介質(zhì)，在外周和中樞敏感化方面起著十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在局部注射完全弗氏佐劑、角叉菜膠及酵母多糖等引起的機(jī)械性痛覺過敏的過程中，脊髓背角中COX-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高［13］?？梢娂顾柚蠧OX-2在外周炎癥誘發(fā)中樞機(jī)械性痛覺過敏的進(jìn)程中起著重要作用。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在形成穩(wěn)定的神經(jīng)根炎性痛后pERK和COX-2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，且兩者呈較強(qiáng)的正相關(guān)，由此可推測ERK信號通路激活后可通過調(diào)控COX-2基因的表達(dá)介導(dǎo)機(jī)械性痛覺過敏。

3.3 蛇床子素與盤源性腰腿痛的關(guān)系 隨著近年來對盤源性腰腿痛機(jī)制研究的不斷深入，大量研究結(jié)果表明，腰椎間盤突出物引起的臨床疼痛癥狀和神經(jīng)根體征與突出物的病理形態(tài)和對神經(jīng)根的機(jī)械壓迫無明確關(guān)系 ，而與局部炎癥的聯(lián)系極為緊密［14］。因此，我們推測蛇床子素主要是通過其強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)和抗炎效應(yīng)達(dá)到緩解DLBP的作用。目前，蛇床子素治療DLBP的機(jī)制主要可概括為以下幾個方面:(1)通過抑制關(guān)鍵信號通路，減少炎性介質(zhì)的表達(dá)［6，15］，本研究證實(shí)了蛇床子素可通過抑制脊髓背角ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少COX-2基因的表達(dá)，從而達(dá)到緩解機(jī)械通敏的作用;(2)通過對細(xì)胞膜上的某些離子通道，如Na+通道［16］、電壓依賴性 L-鈣通道［17］和 3 型酸敏感離子通道 ASIC3［8］等的直接調(diào)控作用，降低神經(jīng)元興奮性，防止中樞敏化的形成;(3)長期大量興奮性遞質(zhì)的釋放會導(dǎo)致中樞抑制性中間神經(jīng)元對傷害性信息傳遞的抑制作用減弱，甚至引起抑制性神經(jīng)元的凋亡，從而導(dǎo)致痛覺過敏。這種中樞去抑制作用是DLBP的重要發(fā)生機(jī)制之一。而蛇床子素能降低中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，并具有神經(jīng)保護(hù)作用，可通過減少中樞抑制性神經(jīng)元的凋亡防治痛敏;(4)通過抗凝作用，減少毛細(xì)血管血栓形成以及增加背根神經(jīng)節(jié)血供等途徑產(chǎn)生協(xié)同作用。

綜上所述，ERK/MAPK信號通路在髓核導(dǎo)致的神經(jīng)根炎性疼痛中扮演著重要角色，本研究證實(shí)蛇床子素可通過抑制ERK信號通路的激活下調(diào)COX-2的表達(dá)而緩解痛覺過敏。因此，本研究為蛇床子素治療椎間盤突出導(dǎo)致的神經(jīng)根炎性痛提供了一個新的理論依據(jù)，為臨床上開發(fā)新的抗炎鎮(zhèn)痛藥物提供了新的科學(xué)指導(dǎo)。

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