葛治娟，于金梅，馬曉蕓，劉曉燕，鄭建全

(1.中南大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙 410013;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850)

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin releasing factor，CRF)是由41個氨基酸組成的多肽，是應(yīng)激條件下的主要神經(jīng)遞質(zhì)，在下丘腦室旁核表達(dá)量較高，并在邊緣結(jié)構(gòu)廣泛分布［1］。CRF負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)自主神經(jīng)、免疫、生理等與應(yīng)激相關(guān)的反應(yīng)。CRF主要是通過與其受體結(jié)合來發(fā)揮作用，CRF受體可分為CRFR1和CRFR2兩個亞型。CRFR1在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布，CRFR2主要在外周分布。腦內(nèi)CRF主要與CRFR1結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)［2］。目前，眾多研究表明CRFR1已經(jīng)成為抗抑郁癥與焦慮癥的潛在靶標(biāo)［3］。但CRFR1介導(dǎo)的胞內(nèi)信號通路尚不清楚，本研究試圖建立穩(wěn)定表達(dá)CRFR1的HEK293細(xì)胞株，為進(jìn)一步闡明CRFR1信號通路和分子機(jī)制，以及篩選靶向CRFR1受體藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司;Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司;牛血清白蛋白 V、胰蛋白酶(1∶250)、G418均購自 Amresco公司;TRIzol購自Invitrogen公司;RT-PCR購自北京信諾金達(dá)公司;Pierce?BCA Protein Assay Kit購自 Thermo公司;蛋白Marker購自 Fermentas公司;小鼠抗 β-actin抗體、山羊抗兔IgG/HRP二抗購自中杉金橋公司;兔抗CRFR1抗體購自Bioworld公司;近紅外染料標(biāo)記的二抗購自LI-COR公司;pcDNA3.1-hCRFR1質(zhì)粒由UMR cDNA Resource Center提供;CRF購自Tocris公司;IBMX購自Sigma公司;LANCETMcAMP 384試劑盒購自PerkinElmer公司。BX51熒光顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司;GENios Pro多功能酶標(biāo)儀購自Tecan公司;384孔酶標(biāo)板購自PerkinElmer公司;Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)購自基因有限公司。

1.2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株HEK293-CRFR1的構(gòu)建將對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，過夜培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)80%融合時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將hCRFR1質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體混合物加入待轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中。4 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后換含800 mg·L－1G418的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)株，約2周后挑取單克隆鑒定，擴(kuò)大培養(yǎng)，換含800 mg·L－1G418的培養(yǎng)基維持篩選。

1.3 RT-PCR法鑒定CRFR1 mRNA的表達(dá) 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293-CRFR1細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA為模板，用CRFR1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序設(shè)為:95℃預(yù)變性5 min，94℃ 變性1 min，55℃ 退火1 min，循環(huán)35次;最后72℃ 延伸7 min。以GAPDH為內(nèi)參，PCR產(chǎn)物用0.016 mol·L－1瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 Western blot法鑒定CRFR1蛋白的表達(dá) 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293-CRFR1細(xì)胞，提取蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定。取變性后的蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后用轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將膜于封閉液中封閉1 h。加一抗后，4℃孵育過夜。近紅外染料標(biāo)記的二抗于37℃孵育1 h，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)分析。

1.5 免疫熒光法評價CRFR1的轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞提前24 h接種于24孔板中。冰甲醇固定30 min，PBS漂洗，F(xiàn)BS 4℃封閉。加入HA一抗，4℃過夜，紅色標(biāo)記的熒光二抗室溫避光孵育60 min，PBS漂洗，用熒光顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.6 CRF刺激HEK293-CRFR1細(xì)胞釋放cAMP的量效曲線 按照LANCETMcAMP 384試劑盒說明書操作，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293-CRFR1細(xì)胞于培養(yǎng)皿(d=6 cm)中培養(yǎng)，至融合度為85%時，用無酶的消化液于37℃消化細(xì)胞，加入HBSS終止消化，1 000 r·min－1離心5min，用刺激緩沖液收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液用cAMP抗體稀釋，在384孔酶標(biāo)板同CRF共同孵育30 min后，加入檢測混合物，于酶標(biāo)儀上測定熒光值。繪制cAMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR鑒定 CRFR1 mRNA的表達(dá) 以GAPDH作為內(nèi)參，以質(zhì)粒hCRFR1作為陽性對照，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，1號和2號克隆CRFR1 mRNA的表達(dá)陽性，3號和4號克隆CRFR1 mRNA的表達(dá)陰性;并且GAPDH表達(dá)量相同時，2號克隆CRFR1 mRNA的表達(dá)量最高。見Fig 1。

Fig 1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

2.2 Western blot鑒定 HA-CRFR1蛋白表達(dá)HEK293-pcDNA3.1細(xì)胞蛋白作為陰性對照?？寺?、2、3HA-CRFR1蛋白的表達(dá)陽性，4號克隆 HACRFR1蛋白的表達(dá)陰性;在β-actin作為參照下，蛋白表達(dá)量最高的為2號克隆HA-CRFR1。與RTPCR結(jié)果相符，見Fig 2。

Fig 2 Western blot Results

2.3 免疫熒光鑒定2號克隆HA-CRFR1蛋白的表達(dá)及評價轉(zhuǎn)染效率 以正常生長的HEK293細(xì)胞為陰性對照(Fig 3A)，免疫熒光顯示，2號克隆CRFR1表達(dá)量較高(Fig 3B)。以未染色HEK293-CRFR1細(xì)胞為空白對照(Fig 3C)，以HA抗體免疫熒光染色的HEK293-CRFR1細(xì)胞相對空白對照評價轉(zhuǎn)染效率(Fig 3D)。

Fig 3 Transfection of CRFR1 to HEK293 cells under fluorescent microscope

2.4 CRF刺激HEK293-CRFR1細(xì)胞釋放cAMP的量效曲線 用 Origin 8.0軟件對 CRF刺激HEK293-CRFR1細(xì)胞釋放cAMP作圖，量效曲線擬合良好，R2=0.9967，EC50=(5.64 ±0.05)×10－10mol·L－1，見 Fig 4。

上述結(jié)果表明，HEK293-CRFR1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功，并且CRF刺激HEK293-CRFR1細(xì)胞釋放cAMP量效曲線擬合良好［EC50=(5.64±0.05)×10－10mol·L－1，n=3］，說明由 CRFR1 介導(dǎo)的cAMP釋放評價體系構(gòu)建成功。

Fig 4 CRF dose-response curve obtained with CRFR1-HEK293 cells

3 討論

CRFR1是典型的 G 蛋白偶聯(lián)受體［3］，CRFR1除了在腺垂體高表達(dá)外，在海馬、杏仁核、紋狀體、藍(lán)斑和中縫背核等情感相關(guān)腦區(qū)都富含CRFR1。CRF激活 CRFR1可通過 AC-cAMP-PKA、ERK-MAPK、PLC-IP3等信號通路來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［4］。目前，認(rèn)為CRFR1偶聯(lián)并激活多種G蛋白，并且優(yōu)先偶聯(lián)于Gs蛋白。CRF的諸多作用都是由Gs介導(dǎo)的AC-cAMP-PKA信號傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的，CRF與CRFR1結(jié)合后，通過偶聯(lián)Gs蛋白激活細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cAMP含量增加，從而激活蛋白激酶A，引發(fā)一系列生物效應(yīng)［5］。CRF誘導(dǎo)cAMP產(chǎn)生，可在表達(dá)CRFR1的HEK293細(xì)胞上檢測。通過比較藥物誘導(dǎo)cAMP產(chǎn)生的半數(shù)有效濃度可比較不同藥物間的差異［6］。

本實(shí)驗(yàn)Western blot、RT-PCR、免疫熒光的數(shù)據(jù)表明，穩(wěn)定表達(dá)CRFR1的HEK293細(xì)胞株構(gòu)建成功，并且HEK293-CRFR1細(xì)胞釋放cAMP的量效曲線［EC50=(5.64 ±0.05)×10－10mol·L－1，n=3］擬合良好［4］，說明評價體系構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)中以HEK293細(xì)胞為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，研究發(fā)現(xiàn)，在正常的HEK293細(xì)胞中，Northern blot雜交實(shí)驗(yàn)可檢測到2.7 kb CRFR1 mRNA的條帶。但目前還沒有數(shù)據(jù)證明 HEK293細(xì)胞中有 CRFR2的表達(dá)。盡管HEK293細(xì)胞中有CRFR1的表達(dá)，但轉(zhuǎn)染后的受體表達(dá)量比本體受體表達(dá)量高出40～400倍，因此，內(nèi)源受體表達(dá)CRFR1的影響可以忽略［7］。近來的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)G蛋白偶聯(lián)受體本身具有固有活性，即沒有激動劑條件下，受體自發(fā)的維持和激活下游信號傳導(dǎo)通路的活性。研究表明，受體在細(xì)胞中的表達(dá)量增加，受體對于激動劑的反應(yīng)和無激動劑條件下受體的固有活性也增加［8］。因此，本實(shí)驗(yàn)中，由于受體固有活性的影響，以 CRF刺激HEK293-CRFR1細(xì)胞釋放cAMP為參照標(biāo)準(zhǔn)，可通過比較HEK293-CRFR1細(xì)胞株cAMP響應(yīng)的差異，篩選CRFR1受體激動劑。并且CRFR1拮抗劑類藥物對于HEK293-CRFR1細(xì)胞被內(nèi)源性配體激活釋放cAMP的影響，可用來篩選受體拮抗劑，并可用于進(jìn)一步研究CRFR1受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［9］。

臨床研究表明，長期慢性應(yīng)激會增加腦脊液中CRF表達(dá)量，與 CRFR1結(jié)合導(dǎo)致促腎上腺皮質(zhì)激素分泌過多，使糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的HPA負(fù)反饋回路發(fā)生障礙，并持續(xù)亢進(jìn)，從而導(dǎo)致抑郁癥一類的精神疾病的發(fā)生［10］。大量的數(shù)據(jù)表明，CRF系統(tǒng)在應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控中起重要作用［11］，CRFR1拮抗劑對不同的動物抑郁模型有抗抑郁作用。因此，人們越來越重視CRF受體拮抗劑治療作用的研究，開發(fā)新藥治療應(yīng)激相關(guān)的疾病如抑郁癥、焦慮癥［12］。許多CRFR1拮抗劑類藥物進(jìn)入臨床研究，但目前取得的結(jié)果卻不容樂觀。目前，應(yīng)用的CRFR1拮抗劑大多有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此，找到更多不同的CRFR1拮抗劑類化合物，開發(fā)特異性CRFR1激動劑能為我們治療應(yīng)激相關(guān)病癥提供良好的前景［13］。

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