徐靜濤，張 付，楊幸怡，謝衛(wèi)兵，李麗增，劉 超，王慧君

(1.南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院法醫(yī)學系暨南方醫(yī)科大學司法鑒定中心，廣東廣州 510515;2.廣東省公安廳公安部法醫(yī)病理重點實驗室，廣東廣州 510050;3.廣州市公安局刑事科學技術(shù)研究所，廣東廣州 510030)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)俗稱“冰毒”，屬于苯丙胺類興奮劑，是最具代表性和最常見的新型毒品。2000年以后，迅速成為我國濫用增長速度最快的毒品，吸毒人群年輕化和非法制造冰毒業(yè)的存在，使我國冰毒濫用已成為嚴重的社會問題［1-2］。目前，關(guān)于METH的神經(jīng)毒性機制，國內(nèi)外研究結(jié)果尚未完全明確。現(xiàn)階段的研究結(jié)果顯示，多種機制參與了METH的神經(jīng)毒性，主要包括氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡、興奮性毒性、線粒體功能障礙等［3-5］，其中氧化應(yīng)激是METH所致神經(jīng)毒性損傷的重要作用機制之一［6-7］。

本實驗室運用蛋白質(zhì)組學的方法，對METH注射后大鼠紋狀體、額葉皮質(zhì)、海馬等部位的差異表達蛋白質(zhì)進行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)了一種新型的NO合成調(diào)節(jié)酶二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)表達上調(diào)，提出了 DDAH1/ADMA/NOS系統(tǒng)可能是NO過表達引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要途徑［8］。

氧化應(yīng)激是METH神經(jīng)毒性損傷作用的重要機制之一。METH作用后導(dǎo)致神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)活性增強;同時，我們課題組的一項研究結(jié)果也顯示，METH可導(dǎo)致腦組織中NO濃度上升［9］。氧化應(yīng)激過程中生成的過量NO和自由基生成毒性產(chǎn)物ONOO-，可能對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷作用。為了進一步明確NOS在METH中毒模型中的作用及其與METH神經(jīng)毒性的關(guān)系，本研究通過構(gòu)建加入METH和nNOS特異性的抑制劑7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)的大鼠模型，進一步完善DDAH1/ADMA/NOS通路的神經(jīng)毒性作用機制，為進一步研究nNOS活性變化與METH神經(jīng)毒性的關(guān)系提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠24只，♂，體質(zhì)量(300±5)g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑和儀器 鹽酸甲基苯丙胺購自中國藥品生物制品鑒定所(批號:171212，200803)，純度大于99%;7-NI購自Sigma公司;兔抗鼠nNOS多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(1∶8 000稀釋)均購自北京博奧森生物公司;Tunel熒光法檢測試劑盒購自羅氏公司。高速冷凍離心機購自Sigma-Aldrich公司;瓊脂凝膠電泳儀購自Jun-Yi公司;熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理 大鼠隨機分為4組，每組6只動物。動物單籠飼養(yǎng)，自由飲水、取食。實驗前先在飼養(yǎng)室適應(yīng)3 d。提前將216 mg METH溶解于48 ml純水中，720 mg的7-NI溶解于30 ml的溶液(DMSO ∶異丙醇 ∶純水 =1∶3∶6)中，在注射METH前30 min給SD鼠進行腹腔注射含有7-NI的混合液。第1組(生理鹽水組):腹腔注射生理鹽水，早晚各1次，連續(xù)注射3 d;第2組(METH組):腹腔注射METH，15 mg·kg-1，早晚各1次7.5 mg·kg-1，連續(xù)注射3 d;第3組(METH+7-NI組):METH注射方法同第2組，并且提前30 min在腹腔注射7-NI，注射劑量為50 mg·kg-1;第4組(7-NI組):腹腔注射生理鹽水方法同第1組，并且提前30 min腹腔注射7-NI，劑量為50 mg·kg-1。末次注射后24 h，2%戊巴比妥麻醉，用4℃生理鹽水進行腦部灌輸，斷頭處死動物，迅速開顱完整剝離腦組織。沿中線切開，將腦組織分離為左右兩個半球，放入-80℃冰箱保存。

1.3.2 行為學變化的研究 注射METH溶液后，立刻觀察大鼠的行為學情況，并記錄相關(guān)變化，對大鼠的刻板行為評分參照相關(guān)文獻方法［10］。評分標準為:0分:靜止不動，幾乎或根本沒有活動;1分:正?；顒樱紶栍邢蚯暗倪\動;2分:活動伴隨反復(fù)的向前探索;3分:持續(xù)地向前探索;4分:重復(fù)地抬頭、搖頭或旋轉(zhuǎn);5分:迅速地搖頭、旋轉(zhuǎn)或搖頭的背腹運動。

1.3.3 大鼠紋狀體的提取和處理 分別取每組6個樣品的一側(cè)腦半球，放在DEPC水處理過的培養(yǎng)皿上，將玻片置于冰盒上，在一側(cè)腦半球距中線1 mm和3 mm處作矢狀切面，取兩切口之間的腦組織(為距中線1～3 mm之間，厚度為2 mm的腦組織片)［11］，平放于培養(yǎng)皿上分離切取紋狀體，-80℃冰箱保存。

1.3.4 Western blot檢測大鼠紋狀體nNOS和硝基化蛋白表達 將每組6個腦半球中紋狀體中部分組織兩兩混合，移入勻漿器，加入裂解液;高速冷凍離心機15 000 r·min-1，4℃離心10 min;取上清液，加4倍體積冷丙酮-20℃過夜，15 000 r·min-14℃離心30 min;將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂奶粉TBST緩沖液封閉1 h。一抗分別為兔抗鼠nNOS多克隆抗體(1∶1 000稀釋)和兔抗鼠3-硝基酪氨酸單克隆抗體(美國Abcam公司，1 ∶1 000稀釋)，0.1 ml/cm2膜面積，4℃孵育過夜，然后，加入二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，1∶8 000稀釋)，室溫孵育90 min，常規(guī)漂洗。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室中曝光到X線片上。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.3.5 酶聯(lián)免疫分析(ELISA)法檢測紋狀體DA含量 按照ELISA試劑盒說明書的要求，檢測各組組織的DA含量，以空白孔進行調(diào)零，在450 nm波長處，使用酶標儀測量各孔的吸光度，所得數(shù)據(jù)經(jīng)電腦軟件處理得到各組DA含量。

1.3.6 應(yīng)用Tunel熒光法檢測細胞凋亡 每組隨機取3個待測的腦半球，在Bregma-0.36 mm處冠切，冰凍切片浸入固定液，室溫固定30 min，然后室溫封閉10 min，浸入通透液中冰上(2～8℃)促滲2 min。陽性對照組織樣本再加入DNase I反應(yīng)液，室溫處理30 min后，加入TdT反應(yīng)液，37℃反應(yīng)60 min，陰性對照樣本在標記反應(yīng)的過程中不添加TdT酶反應(yīng)液。將處理好的樣本滴加Mounting Media封片劑。綠色熒光濾光片465～495 nm波長下激發(fā)熒光。雙染細胞核 (DAPI和 TUNEL)，DAPI染藍色熒光，TUNEL染綠色熒光，經(jīng)由Merged后，重疊部位即為細胞進行凋亡的位置。每個切片取4個視野，分別統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，并計算出細胞凋亡率。

1.3.7 統(tǒng)計學處理 實驗結(jié)果的統(tǒng)計學處理用SPSS 13.0軟件進行。行為學結(jié)果不同分組間指標值比較采用析因設(shè)計的重復(fù)測量方差分析，重復(fù)因素為注射次數(shù)，當資料不滿足球形檢驗時采用Greenhouse-Geisser法;采用調(diào)整的基于估計邊緣均值的LSD法進行不同分組間指標值的多重比較。其余各結(jié)果比較均采用單因素方差分析(One-way-ANOVA)，組間比較根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果采用LSD法或Dunnett T3法分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學改變 對照組和7-NI組大鼠注射生理鹽水后，行為活動與正常大鼠無異。METH組和METH+7-NI組大鼠注射METH后約10 min開始出現(xiàn)行為和活動異常，主要表現(xiàn)為運動增多、不自主的扭頭和點頭、嚙齒(磨牙)、立毛、遇響動或輕微刺激易激惹、自發(fā)轉(zhuǎn)圈運動、翹尾，個別動物啃咬前肢皮膚、搔抓胸前部皮膚等，出現(xiàn)自殘行為。行為活動異常持續(xù)至注射后約4 h，之后動物表現(xiàn)為倦怠、蜷縮，活動減少。析因設(shè)計的重復(fù)測量方差分析結(jié)果表明:不同分組間指標值差異有顯著性(F=710.109，P＜0.01);不同注射次數(shù)間指標值差異無顯著性(F=2.157，P＞0.05);分組與注射次數(shù)間的交互效應(yīng)不明顯(F=0.611，P＞0.05)，即分組間的差別不隨注射次數(shù)的不同而改變，如輪廓Fig 1顯示。采用調(diào)整的基于估計邊緣均值的LSD法進行不同分組間指標值的多重比較，METH組、METH+7-NI組的指標值均明顯高于7-NI、Control組(P＜0.01)，METH、METH+7-NI組間差異無顯著性(P＞0.05)，7-NI、Control組間差異無顯著性(P＞0.05)。

Fig 1 Profile plots of stereotyped behavior of rats

2.2 大鼠紋狀體nNOS蛋白和硝基化蛋白的表達情況 大鼠紋狀體nNOS蛋白Western blot結(jié)果如Fig 2所示，METH組和METH+7-NI組均發(fā)現(xiàn)目的蛋白條帶，生理鹽水組和7-NI組均未發(fā)現(xiàn)目的蛋白條帶。METH組紋狀體中nNOS蛋白表達水平較生理鹽水組明顯升高(P＜0.01)，而METH+7-NI組nNOS表達水平較METH組明顯降低，相差約3.91倍(P＜0.01)。大鼠紋狀體硝基化蛋白Western blot結(jié)果如Fig 3所示，生理狀態(tài)下硝基化蛋白有少量的表達;在METH毒性作用下，50 ku和80 ku范圍處，硝基化蛋白表達明顯升高，總體升高水平約為對照組的3.62倍(P＜0.01);7-NI可有效降低硝基化蛋白的表達，與METH組相比相差約2.17倍(P＜0.01)。

Fig 2 Relative expression of nNOS protein

Fig 3 Relative expression of nitroproteins

2.3 紋狀體DA含量 各組間比較采用單因素方差分析，經(jīng)方差齊性檢驗，方差齊，多重比較采用Shapiro-Wilk法，結(jié)果見Fig 4。各組間比較差異有顯著性(F=30.575，P＜0.01)，METH組與其他各組相比，DA明顯降低(P＜0.01)，而METH+7-NI組、7-NI組與對照組比較，DA無差異(P＞0.05)。

2.4 Tunel法檢測大鼠紋狀體細胞凋亡情況Tunel結(jié)果表明(Fig 5)，各組間比較差異有顯著性(F=192.786，P＜0.01)，METH 神經(jīng)毒性作用可引起神經(jīng)細胞發(fā)生大量的凋亡(33.23%，P＜0.01)，而7-NI對凋亡具有明顯的保護作用，可使凋亡率下降至12.91%，約為2.57倍(P＜0.01)。

Fig 4 DA contents in striatum of rats

3 討論

METH的分子結(jié)構(gòu)與DA非常相似，能夠通過多巴胺能神經(jīng)元軸突細胞膜的多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)進入胞內(nèi)，引起突觸小泡內(nèi)所儲存的DA和5-羥色胺(5-HT)大量釋放進入細胞質(zhì)內(nèi)和突觸間隙內(nèi)，從而引發(fā)一系列的神經(jīng)毒性作用［12］。在眾多損傷機制中，氧化應(yīng)激反應(yīng)與DA的大量釋放之間關(guān)系最為密切:過量的DA可引起醌類和超氧化物自由基的不斷生成，通過氧化作用對神經(jīng)細胞及末梢產(chǎn)生廣泛性的損傷［13］。氧化應(yīng)激損傷的分子機制主要依賴于兩種有害氧化成分的大量形成，即活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)。

Fig 5 Protective effect of 7-NI on apoptosis in striatum of rats treated with METH by Tunel stain

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是體內(nèi)催化合成一氧化氮的一組蛋白酶，其中nNOS主要分布于神經(jīng)細胞，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)NO濃度。NO主要由精氨酸經(jīng)NOS分解產(chǎn)生，正常生理條件下，NO作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，在大腦內(nèi)存在一定的濃度，可調(diào)制神經(jīng)細胞的可塑性，并參與記憶和學習過程［14-16］。病理條件下，NO可與氧自由基反應(yīng)生成過氧亞硝酸鹽(ONOO-)，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA氧化，還可使蛋白質(zhì)酪氨酸殘基發(fā)生硝基化，導(dǎo)致細胞功能異常［17］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，METH可誘導(dǎo)NO大量生成［18］，隨即產(chǎn)生具有強氧化性的神經(jīng)毒素ONOO-［19］。而ONOO-的主要毒理作用就是針對蛋白質(zhì)的3位酪氨酸進行硝基化修飾，形成3-硝基酪氨酸(3-NT)。正常水平的3-NT有助于維持蛋白質(zhì)的生理功能，而過度的硝基化作用則傾向于抑制和破壞蛋白質(zhì)的功能［20］，這可能是METH神經(jīng)毒性的重要分子機制。

本研究運用Western blot方法，證明METH導(dǎo)致大鼠紋狀體nNOS蛋白表達增高以及部分硝基化蛋白水平升高，說明METH通過影響nNOS的活性，導(dǎo)致腦組織內(nèi)NO生成增加，從而引發(fā)損傷性的蛋白質(zhì)硝基化作用。盡管研究結(jié)果顯示過量NO會對神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，但為了進一步驗證NOS活性升高和METH的神經(jīng)毒性相關(guān)性，我們應(yīng)用了nNOS特異性的抑制劑7-NI，探討NOS活性變化與METH神經(jīng)毒性的關(guān)系。

我們的結(jié)果顯示，在METH給藥前預(yù)先給動物注射7-NI，能明顯抑制METH導(dǎo)致的紋狀體DA含量減少，紋狀體內(nèi)DA量的變化是評價METH神經(jīng)毒性的主要指標。通過Tunel法進行凋亡細胞染色，我們發(fā)現(xiàn)METH能明顯增加大鼠紋狀體細胞凋亡率，考慮上述毒性作用可能由于METH致使機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，多巴胺通道轉(zhuǎn)運功能障礙，毒性產(chǎn)物蓄積，最后導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡［21-23］。預(yù)先給予7-NI保護劑組與METH組相比，凋亡細胞明顯減少，但尚未降至對照組水平。該結(jié)果進一步證實了NOS是METH引起細胞凋亡一個關(guān)鍵因素，7-NI對其有一定程度的保護作用。但由于METH所致的神經(jīng)細胞的凋亡是多因素、多途徑共同作用的結(jié)果，單純抑制NOS尚不足以使細胞凋亡的程度下降至正常水平。

以往相關(guān)研究表明，7-NI能夠在小鼠體內(nèi)有效保護METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，可以緩解DA耗竭和DAT異常下降，并且能夠降低小鼠死亡率，以上結(jié)論為我們的研究起到了有益的補充和支持［24-25］。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步證明，METH誘導(dǎo)的大鼠紋狀體凋亡與nNOS及其下游的蛋白質(zhì)硝基化作用可能具有相關(guān)性，這一成果屬于首次發(fā)現(xiàn)，為今后進一步探索氧化應(yīng)激作用在METH神經(jīng)毒性中的分子病理機制提供了可靠依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射METH后，出現(xiàn)交感神經(jīng)興奮、刻板運動、運動增多、精神改變、易激惹等行為，甚至出現(xiàn)自殘現(xiàn)象。METH應(yīng)用7-NI預(yù)處理后，對刻板行為無明顯改善，可能是由于METH的神經(jīng)毒性損害是多因素、多途徑參與的過程，單獨抑制NOS活性不能完全改善其毒性損害的行為學表現(xiàn)。

總之，本實驗研究結(jié)果初步顯示，METH可導(dǎo)致nNOS活性增高、蛋白質(zhì)硝基化水平升高、DA含量的降低及細胞凋亡增多等多種神經(jīng)毒性表現(xiàn)，而nNOS特異抑制劑7-NI能部分減輕其神經(jīng)毒性作用，但對于動物刻板行為沒有保護作用。這些結(jié)果為今后應(yīng)用此動物模型進一步研究nNOS下游通路的作用機制奠定了良好的基礎(chǔ)。

［1］叢敏超，鮑彥平，呂憲祥，等.我國藥物濫用監(jiān)測工作調(diào)研［J］.中國藥物依賴性雜志，2013，22(5):386-93.

［1］Cong C M，Bao Y P，Lü X X，et al.The research on the status of national drug abuse surveillance system［J］.Chin J Drug Depend，2013，22(5):386-93.

［2］何榮功.十年來我國毒品濫用趨勢與特點的實證分析—兼論我國毒品治理方向的調(diào)整［J］.遼寧大學學報:哲學社會科學版，2012，40(2):117-23.

［2］He R G.An empirical analysis on the trends and features about abuse of drug in China in the past decade［J］.J Liaoning Univ(Philosophy and Social Sciences)，2012，40(2):117-23.

［3］Murphy A N，F(xiàn)iskum G，Beal M F.Mitochondria in neurodegeneration:bioenergetic function in cell life and death［J］.J Cereb Blood Flow Met，1999，19(3):231-45.

［4］Deng X，Cai N S，McCoy M T，et al.Methamphetamine induces apoptosis in an immortalized rat striatal cell line by activating the mitochondrial cell death pathway［J］.Neuropharmacology，2002，42(6):837-45.

［5］Kita T，Wagner G C，Nakashima T.Current research on methamphetamine-induced neurotoxicity:animal models of monoamine disruption［J］.J Pharmacol Sci，2003，92(3):178-95.

［6］宋健文，劉增甲，譚曉輝，等.N-乙酰半胱氨酸減輕大鼠紋狀體甲基苯丙胺神經(jīng)毒性［J］.中國藥理學通報，2009，25(6):765-9.

［6］Song J W，Liu Z J，Tan X H，et al.N-acetylcysteine attenuates methamphetamine induced neurotoxicity in rat striatum［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(6):765-9.

［7］王雙雙，楊敏慧，何 瓊，等.甲基苯丙胺致大鼠神經(jīng)毒性及紋狀體硝化作用的改變［J］.中國藥理學通報，2010，26(3):317-20.

［7］Wang S S，Yang M H，He Q，et al.Methamphetamine neurotoxicity and changes of nitration in rats striatum［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(3):317-20.

［8］Li X F，Wang H J，Qiu P M，et al.Proteomic profiling of proteins associated with methamphetamine-induced neurotoxicity in different regions of rat brain［J］.Neurochem Int，2008，52(1-2):256-64.

［9］陳 漢，王慧君，李學鋒，等.甲基苯丙胺對大鼠腦組織中NO，SOD和MDA的影響［J］.中國藥物依賴性雜志，2007，16(2):102-4.

［9］Chen H，Wang H J，Li X F，et al.Change of NO，SOD and MDA in methamphetamine-treated rat brain and their correlation［J］.Chin J Drug Depend，2007，16(2):102-4.

［10］Sams-Dodd F.Phencyclidine-induced stereotyped behaviour and social isolation in rats:a possible animal model of schizophrenia［J］.Behav Pharmacol，1996，7(1):3-23.

［11］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1985:109-28.

［11］Bao X M，Shu X Y.The rat brain in stereotaxic coordinates［M］.Beijing:People's Medical Publishing House，1985:109-28.

［12］Iversen L.Neurotransmitter transporters and their impact on the development of psychopharmacology［J］.Br J Pharmacol，2006，147(Suppl 1):S82-8.

［13］LaVoie M J，Hastings T G.Dopamine quinone formation and protein modification associated with the striatal neurotoxicity of methamphetamine:evidence against a role for extracellular dopamine［J］.J Neurosci，1999，19(4):1484-91.

［14］Susswein A J，Katzoff A，Miller N，et al.Nitric oxide and memory［J］.Neuroscientist，2004，10(2):153-62.

［15］Ledo A，F(xiàn)rade J，Barbosa R M，et al.Nitric oxide in brain:diffusion，targets and concentration dynamics in hippocampal subregions［J］.Mol Aspects Med，2004，25(1-2):75-89.

［16］Huang E P.Synaptic plasticity:a role for nitric oxide in LTP［J］.Curr Biol，1997，7(3):R141-3.

［17］Liu D，Ling X，Wen J，et al.The role of reactive nitrogen species in secondary spinal cord injury:formation of nitric oxide，peroxynitrite，and nitrated protein［J］.J Neurochem，2000，75(5):2144-54.

［18］Itzhak Y，Ali S F.Role of nitrergic system in behavioral and neurotoxic effects of amphetamine analogs ［J］.Pharmacol Ther，2006，109(1-2):246-62.

［19］Pacher P，Beckman J S，Liaudet L.Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease［J］.Physiol Rev，2007，87(1):315-424.

［20］Lopes M A，Meisel A，Carvalho F D，et al.Neuronal nitric oxide synthase is a key factor in doxorubicin-induced toxicity to rat-isolated cortical neurons［J］.Neurotox Res，2011，19(1):14-22.

［21］Fleckenstein A E，Volz T J，Riddle E L，et al.New insights into the mechanism of action of amphetamines［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2007，47:681-98.

［22］Wink D A，Mitchell J B.Chemical biology of nitric oxide:Insights into regulatory，cytotoxic，and cytoprotective mechanisms of nitric oxide［J］.Free Radic Biol Med，1998，25(4-5):434-56.

［23］Brown G C.Regulation of mitochondrial respiration by nitrix oxide inhibition of cytochrome c oxidase［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1054(1):46-57.

［24］Itzhak Y，Ali S F.The neuronal nitric oxide synthase inhibitor，7-nitroindazole，protects against methamphetamine-induced neurotoxicityin vivo［J］.J Neurochem，1996，67(4):1770-3.

［25］Di Monte D A，Royland J E，Jakowec M W，et al.Role of nitric oxide in methamphetamine neurotoxicity:protection by 7-nitroindazole，an inhibitor of neuronal nitric oxide synthase［J］.J Neurochem，1996，67(6):2443-50.