唐向榮 嚴(yán)提珍△ 林墨菊 楊艷 唐寧 李伍高 黃麗輝

1 柳州市婦幼保健院（柳州 545001）；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院

第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查顯示，我國有聽力殘疾人2 780萬，其中0～6歲聽障兒童13.7萬，重度及以上聽力殘疾兒童為10.2萬［1］。新生兒聽力障礙發(fā)生率約為1‰～3‰，每年僅新出生聾兒高達(dá)2.3萬［2，3］。耳聾的致病因素大致可分為遺傳性因素和非遺傳性因素，約60%為遺傳性因素致聾。在遺傳性聾中約20%為綜合征型聾，絕大部分的遺傳性聾為非綜合征型聾，至今已有65個(gè)遺傳性非綜合征型聾基因位點(diǎn)被定位［4］。國內(nèi)聾病分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，GJB2、SLC26A4、線粒體基因突變是導(dǎo)致中國大部分非綜合征型遺傳性聾發(fā)生的最常見基因［5］，其中GJB2突變可導(dǎo)致先天性聾，SLC26A4基因突變可導(dǎo)致前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大［6］，兩者均為常染色體隱性遺傳；線粒體基因突變所致耳聾主要與氨基糖苷類藥物使用有關(guān)，為母系遺傳。本文采用遺傳性聾基因芯片，對(duì)廣西84例非綜合征型聾患者進(jìn)行4個(gè)耳聾基因9個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，分析該組患者耳聾相關(guān)基因突變的檢出率，探討非綜合征型聾的可能遺傳性致病因素。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象為2010年1月至2012年6月在柳州市婦幼保健院兒童聽力診斷中心診斷為非綜合征型聾的患者共84例，漢族26例、壯族24例、苗族9例、瑤族6例、侗族10例、仫佬族4例、毛南族2例，水族2例，回族1例。來自廣西14個(gè)地級(jí)市，年齡6個(gè)月～33歲，其中中度聾2例，重度以上聾82例；11例明確有耳聾家族史，余73例為散發(fā)病例。所有患者均接受耳聾相關(guān)病史采集，包括一般信息、出生史、耳聾發(fā)病年齡、家族史、個(gè)人史（耳聾前傳染病史、耳毒性藥物使用史、頭部外傷史等）、母孕產(chǎn)期情況等，所有患者或家長(zhǎng)均簽署知情同意書。

1.2 顳骨CT檢查 所有患者均進(jìn)行16排螺旋CT顳骨掃描，聽眥線，層厚／層距（mm）：0.6／0.6，窗寬4 000HU，窗位700HU。前庭水管擴(kuò)大的CT判斷標(biāo)準(zhǔn)為：①管道直徑大于1.5mm，②CT示擴(kuò)大的前庭導(dǎo)水管腔大于前庭或深達(dá)總腳旁；③開口雖不大但導(dǎo)水管其他部位內(nèi)徑大于1.5mm［7］。

1.3 DNA提取和濃度測(cè)定 抽取每例患者外周靜脈血3～5ml，EDTA抗凝。利用試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血基因組DNA，提取步驟參照試劑盒提供的使用說明進(jìn)行。利用ND－1000－UV－VIS波長(zhǎng)紫外／可見光掃描分光光度計(jì)（NanoDrop，美國）對(duì)樣本的基因組DNA的提取質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)。DNA樣本的OD260nm／OD280nm比值應(yīng)在1.6～2.0之間，OD260nm／OD230nm比值需≥2.0，濃度需≥1.0ng／μL。

1.4 耳聾基因芯片檢測(cè) 應(yīng)用遺傳性聾基因芯片檢測(cè)試劑盒（北京博奧生物有限公司）對(duì)GJB2基因的 c.35delG、c.176del16、c.235delC、c.299delAT位點(diǎn)，GJB3基因的c.538C＞T位點(diǎn)，SLC26A4基因的c.2168A＞G、c.919－2A＞G位點(diǎn)，線粒體12SrRNA基因的m.1494C＞T、m.1555A＞G位點(diǎn)等共4個(gè)基因9個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 DNA測(cè)序檢測(cè) 通過DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)遺傳性聾基因芯片檢測(cè)為雜合突變和CT顯示前庭水管擴(kuò)大的患者進(jìn)行GJB2和SLC26A4基因序列分析。

2 結(jié)果

2.1 84例非綜合征型聾患者基因芯片檢測(cè)結(jié)果84例中檢出攜帶遺傳性聾相關(guān)基因突變者18例（21.43%，18／84），其中純合突變 5例，復(fù)合雜合突變2例，單雜合突變11例；這18例患者中，GJB2基因突變5例（5.95%，5／84），SLC26A4基因突變12例（14.29%，12／84），線粒體12SrRNA m.1555A＞G均質(zhì)突變1例（1.19%，1／84），未見 GJB3基因突變（表1）。GJB2和SLC26A4基因突變攜帶者占基因突變總例數(shù)的94.44%（17／18）。這18例患者均為極重度感音神經(jīng)性聾，其中攜帶12SrRNA m.1555A＞G均質(zhì)突變的患者氨基糖苷類抗生素應(yīng)用史不詳，其家族中無其他耳聾患者，建議避免使用氨基糖苷類抗生素。在73例散發(fā)病例中檢出15例攜帶基因突變（17.86%，15／73），其中純合突變3例，復(fù)合雜合突變2例，單雜合突變10例；11例有明確耳聾家族史的患者中3例攜帶基因突變（27.27%，3／11），其中純合突變2例，單雜合突變1例。

表1 18例基因突聾者GJB2、SLC26A4、mtDNA 12SrRNA基因型及攜帶率

2.2 5例GJB2基因突變分析結(jié)果 5例GJB2基因突變陽性患者中，1例 GJB2c.35delG／c.235delC復(fù)合雜合突變患兒的父母聽力均正常，基因芯片檢測(cè)顯示父親攜帶GJB2c.35delG雜合突變，母親攜帶GJB2c.235delC雜合突變（圖1），在簽署知情同意書后，母親于第二次懷孕5個(gè)月時(shí)，進(jìn)行了臍帶血穿刺和胎兒基因的診斷，結(jié)果顯示胎兒只攜帶GJB2 c.35delC雜合突變，預(yù)估胎兒不會(huì)發(fā)生遺傳性聾，該小兒出生后順利通過了新生兒聽力篩查，且聽力正常。1例GJB2c.235delC純合突變患兒的父母聽力正常，基因芯片檢出其父母均為GJB2c.235delC雜合突變，正接受再次生育遺傳咨詢。另1例c.35delG／c.235delC復(fù)合雜合突變患兒和1例c.299delAT純合突變患兒的父母不同意接受基因芯片檢查。1例攜帶GJB2c.235delC雜合突變的患者通過GJB2基因序列分析方法進(jìn)一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該患者還攜帶c.109G＞A突變位點(diǎn)，即該患者的基因型為c.109G＞A／c.235delC。

圖1 GJB2基因突變耳聾家系的基因芯片圖譜

2.3 16例前庭水管擴(kuò)大患者SLC26A4基因突變分析結(jié)果（表2） 84例患者中，16例顳骨CT示前庭水管擴(kuò)大，其中1例伴雙側(cè)中耳畸形。這16例中，基因芯片檢測(cè)出SLC26A4基因突變12例（占75.00%，12／16），其中c.919－2A＞G雜合突變10例，c.919－2A＞G純合突變2例；DNA直接測(cè)序進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)10例c.919－2A＞G雜合突變攜帶者中5例還攜帶c.754C＞T突變，3例攜帶c.1229C＞T突變，1例攜帶c.1707＋5A＞G，1例攜帶c.259G＞T。另外，4例基因芯片未檢測(cè)出突變位點(diǎn)的患者，DNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)4例患者的基因型均為c.754C＞T／c.1229C＞T（圖2）。

表2 16例前庭水管擴(kuò)大患者SLC26A4基因芯片聯(lián)合DNA測(cè)序的檢測(cè)結(jié)果

圖2 4例前庭水管擴(kuò)大患者DNA測(cè)序結(jié)果

2.4 11例有耳聾家族史者的基因突變檢測(cè)結(jié)果11例有明確耳聾家族史的患者中，檢出基因突變3例，分別是SLC26A4基因c.919－2A＞G位點(diǎn)純合突變2例，c.919－2A＞G／c.1707＋5A＞G復(fù)合雜合突變1例。1例SLC26A4基因c.919－2A＞G位點(diǎn)純合突變患兒父母均為先天性聾，另1例患者所生女兒亦確診為雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性聾、前庭水管擴(kuò)大；1例c.919－2A＞G／c.1707＋5A＞G復(fù)合雜合突變患兒的舅舅也為先天性聾。

3 討論

根據(jù)國內(nèi)學(xué)者流行病學(xué)研究結(jié)果［2］，在遺傳性感音神經(jīng)性聾患者中，42.41%能夠檢測(cè)出相關(guān)耳聾基因突變，國內(nèi)聾病分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，21%的感音神經(jīng)性聾患者攜帶GJB2基因突變，14.5%的患者攜帶SLC26A4基因突變，3.8%患者攜帶線粒體m.1555A＞G［8］。本研究中84例非綜合征型感音神經(jīng)性聾患者通過基因芯片共檢出18例攜帶耳聾相關(guān)基因突變，檢出率為21.43%（18／84），其中 GJB2基因突變率為5.95%（5／84），SLC26A4基因突變率為14.29%（12／84），線粒體12SrRNA m.1555A＞G均質(zhì)突變率1.19%（1／84），未見GJB3基因突變。本組耳聾人群4個(gè)耳聾基因9個(gè)突變位點(diǎn)總檢出率低于全國平均水平；且GJB2基因突變較SLC26A4基因突變檢出率低，其原因可能是因?yàn)闃颖玖坎粔虼?，分布較廣，尚不能集中說明廣西的發(fā)病情況。

GJB2基因的突變熱點(diǎn)存在種族差異，歐美地區(qū)高加索人中，兒童語前聾患者中有20%是由GJB2基因突變所致，占常染色體隱性遺傳性聾的40%［9］。目前已檢出GJB2基因不同的致病突變中最常見的為c.30－35delG突變，在國人中，12.2%先天性感音神經(jīng)性聾患者為GJB2基因突變所致，其突變的主要方式為c.233－235delC［10］。本組檢出5例GJB2基因突變病例，以c.235del C突變?yōu)橹饕绞剑揖鶠檎Z前聾兒童；其中c.235delC雜合突變的患者經(jīng)過GJB2基因序列分析發(fā)現(xiàn)該患者的基因型為c.109G＞A／c.235delC。最初部分研究者報(bào)道c.109G＞A突變位點(diǎn)為多態(tài)性，在聽力正常人群中也有分布，也有部分研究者認(rèn)為其是致病突變，當(dāng)該突變位點(diǎn)為純合突變或合并GJB2基因其他突變位點(diǎn)（如c.235delC）時(shí)可導(dǎo)致遲發(fā)性聾，發(fā)病年齡在3～8個(gè)月至40多歲不等，表現(xiàn)為輕度或中度感音神經(jīng)性聾［11］。明確遺傳性聾的病因，并通過對(duì)遺傳性聾家庭實(shí)施耳聾基因診斷，可有效阻斷遺傳性聾在家庭成員中的傳遞［11］。對(duì)于確診為GJB2或SLC26A4基因突變致聾的家庭，如果聽力正常的攜帶者夫婦攜帶相同的致聾基因突變，那么生育聾兒的可能性有25%；如果患兒為GJB2基因復(fù)合雜合突變，則為GJB2基因相關(guān)的遺傳性聾的可能性極大，且絕大多數(shù)情況下突變的基因分別來自其父母，通過產(chǎn)前診斷指導(dǎo)生育，可避免再次生育聾兒。本研究中，1例患兒為GJB2c.235delC純合突變，另1例 GJB2c.35delG／c.235delC復(fù)合雜合突變，在簽署知情同意書后，GJB2c.35delG／c.235delC 復(fù)合雜合突變患兒母親第二次懷孕時(shí)，產(chǎn)前基因診斷預(yù)估胎兒不會(huì)發(fā)生遺傳性聾，其出生后證實(shí)聽力正常；GJB2c.235delC純合突變患兒已行人工耳蝸植入術(shù)2年，言語發(fā)育較好，其父母正進(jìn)行再次生育遺傳咨詢?？梢?，遺傳性聾分子病因?qū)W的檢測(cè)已展現(xiàn)出其在聾病病因?qū)W鑒別方面的優(yōu)勢(shì)。

研究發(fā)現(xiàn)，中國人群中97.9%的前庭水管擴(kuò)大患者攜帶SLC26A4基因突變，而c.919－2A＞G突變又占所有突變者的78.9%，該突變?yōu)閲饲巴ニ軘U(kuò)大患者最常見的突變［12］。本組16例顳骨CT示前庭水管擴(kuò)大的患者基因芯片檢測(cè)出SLC26A4基因突變比例為75.00%（12／16），DNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)在基因芯片提示為雜合突變或未檢出突變的前庭水管擴(kuò)大患者中，存在其他SLC26A4基因突變位點(diǎn)（c.259G＞T、c.754C＞T、c.1229C＞T、和c.1707＋5A＞G）；可見，影像學(xué)檢查結(jié)果與SLC26A4基因突變結(jié)果完全吻合?；蛐酒?lián)合DNA測(cè)序可提高前庭水管擴(kuò)大患者SLC26A4基因突變檢出率，同時(shí)也提示在廣西非綜合征型聾人群中SLC26A4基因的突變熱點(diǎn)與全國聾病分子流行病學(xué)調(diào)出的結(jié)果不完全一致，存在一定的區(qū)域差異性。由于本研究的病例有限，是否與民族有關(guān)，尚有待進(jìn)一步的研究。

線粒體12SrRNA基因?yàn)榘被擒疹惪股匾鹚幬镄悦@的相關(guān)基因，m.1555A＞G和m.1494C＞T突變是最重要、最常見的突變，尤其是m.1555A＞G突變。氨基糖苷類抗生素在內(nèi)耳的外淋巴和內(nèi)淋巴聚積，使得m.1555A＞G或m.1494C＞T突變攜帶者的耳蝸細(xì)胞中的線粒體更容易受攻擊，從而對(duì)這些細(xì)胞形成組織特異性的損傷，最終導(dǎo)致攜帶mtDNA基因突變的個(gè)體發(fā)生聽力損失［13］。本組資料中檢出mtDNA基因12SrRNA m.1555A＞G均質(zhì)突變1例，該患兒氨基糖苷類抗生素應(yīng)用史不詳，而家族中無其他耳聾患者，給予藥物使用指導(dǎo)。

本組資料中，11例有明確耳聾家族史的患者中基因芯片檢出常見基因突變3例，其余8例未檢出基因突變。聯(lián)合應(yīng)用基因芯片和DNA測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)有明確耳聾家族史的患者常見基因突變檢出率偏低，提示廣西非綜合征型聾人群中存在4個(gè)常見耳聾基因（GJB2、SLC26A4、GJB3、12SrRNA）以外的其他基因突變，利用外顯子捕獲高通量測(cè)序技術(shù)或全基因組掃描技術(shù)檢測(cè)更多的耳聾基因可能發(fā)現(xiàn)其基因突變，這將是未來的研究方向。

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