王燕飛 賈婧潔 程靜 盧宇 張蕾 韓東一 袁慧軍

1 中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 耳鼻咽喉研究所（北京 100853）

導(dǎo)致耳聾的常見病因中，環(huán)境因素約占40%，遺傳因素約占60%。絕大多數(shù)的遺傳性聾為單基因致病，只有少數(shù)耳聾由多基因聯(lián)合致病。耳聾具有明顯的遺傳異質(zhì)性，即同一表型的耳聾可由不同的基因或突變引起，而不同表型又可由同一致病基因所引起。遺傳性聾分為綜合征型（30%）及非綜合征型聾（70%）［1］，非綜合征型聾包括常染色體顯性遺傳性聾（DFNA）、常染色體隱性遺傳性聾（DFNB）、X－連鎖遺傳性聾（DFNX）、Y－連鎖遺傳性聾（DFNY）及線粒體遺傳性聾。約有20%的非綜合征型聾為常染色體顯性遺傳［2］，主要表現(xiàn)為語后聾，聽力損失呈進行性加重。至2014年4月1日，已報道的與常染色體顯性遺傳非綜合征型聾相關(guān)的基因座有56個，耳聾基因有30個［http：／／hereditaryhearingloss.org］。

近幾年新一代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于遺傳研究領(lǐng)域。全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）是NGS技術(shù)應(yīng)用的一個方面，旨在通過檢測全基因組外顯子及其鄰近區(qū)域DNA序列，鑒定出引起蛋白功能改變的基因變異，用于常見或罕見遺傳性疾病的基因鑒定工作。自2010年以來，相繼報道了14個應(yīng)用NGS技術(shù)新鑒定的耳聾基因，其中非綜合征型聾基因11個，包括1個常染色體顯性遺傳耳聾基因TNC［3］，8個常染色體隱性遺傳耳聾基因BDP1［4］、ELMOD3［5］、OTOGL［6］、TSPEAR［7］、KARS［8］、TBC1D24［9］、GPSM2［10］、TPRN［11］及2個X－連鎖遺傳耳聾基因SMPX［12］和 COL4A6［13］，3個引 起 Perrault綜 合 征 的 基 因 HSD17B4［14］、LARS2［15］、CLPP［16］，以及多個新致聾位點。

本研究對一個常染色體顯性遺傳性聾家系的聽力學(xué)特點和遺傳學(xué)特征進行分析，并應(yīng)用外顯子組測序技術(shù)對其致聾基因進行初步篩查及分析，報告如下。

1 資料與方法

1.1 家系調(diào)查方法 本研究家系的調(diào)查分析已獲得解放軍總醫(yī)院倫理委員會的倫理認證及認可。該家系（編號：HB－Z177）位于河北省，先證者于2010年6月就診于解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門診，分別進行了純音測聽、聲導(dǎo)抗、聽性腦干反應(yīng)、DPOAE及顳骨CT掃描檢查，結(jié)果提示為雙側(cè)對稱的中度至重度感音神經(jīng)性聾，呈進行性加重，聽力曲線呈下降型，該家系成員無明確的耳毒性藥物應(yīng)用史及噪聲接觸史，不伴其他器官系統(tǒng)異常，診斷為遺傳性感音神經(jīng)性聾。2011年4月對該家系成員進行了問卷調(diào)查并簽署知情同意書，對所有受檢者進行了詳細的病史詢問、嚴格的?？茩z查及聽力學(xué)檢測，均采集5～10ml外周靜脈血，用于后續(xù)的基因組DNA提取和遺傳學(xué)特征研究。

1.2 耳聾表型判斷標準 根據(jù)2003年9月Van Camp等［17］提議的《關(guān)于非綜合征型遺傳性聾家系遺傳學(xué)及聽力學(xué)描述術(shù)語建議案》，依據(jù)是否伴其他器官或系統(tǒng)異常，分為非綜合征型和綜合征型聾；按照耳聾出現(xiàn)的時間分為語前聾、語后聾；依據(jù)聽力較好耳0.5～4kHz的平均聽閾將聽力損失程度分為四級，輕度聽力損失為20～40dB HL，中度聽力損失為41～70dB HL，重度聽力損失為71～95dB HL，極重度聽力損失為＞95dB HL。

1.3 全基因外顯子組測序 運用ILLUMINA二代測序平臺進行家系全基因外顯子組測序，選取先證者V2基因組DNA 3～5μg完成建庫后上機測序，并對測序結(jié)果進行基本的數(shù)據(jù)分析，同時從獲得的測序數(shù)據(jù)中選擇高頻單核苷酸變異（SNV）對結(jié)果進行驗證，以確認二代測序數(shù)據(jù)的準確性。

1.4 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計外顯子組樣品測序數(shù)據(jù)生成量以及測序深度和覆蓋度等數(shù)據(jù)。初步查閱擬篩查的變異：①雜合子；②排除千人基因組計劃和寡核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫（database of single nucleotide polymorphism，dbSNP數(shù)據(jù)庫）中已報道的出現(xiàn)頻率≥0.001的SNP及短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）變異；③與已有的耳聾基因數(shù)據(jù)庫進行比較，優(yōu)先篩查已知突變位點。排除已知變異后，參考以往文獻對候選基因的闡述，篩查未知變異，針對測序發(fā)現(xiàn)的SNV及堿基插入或缺失進行質(zhì)控分析，結(jié)合家系常染色體顯性遺傳特征，去除純合狀態(tài)的變異及冗余數(shù)據(jù)，優(yōu)先考慮有重要功能意義的變異；參考用于預(yù)測氨基酸改變是否影響其蛋白功能的點突變預(yù)測（sorting intolerant from tolerant，SIFT）分值（http：／／sift.jcvi.org／www／SIFT＿chr＿coords＿submit.html）和用于預(yù)測非同義突變造成的氨基酸改變是否影響蛋白功能的多態(tài)性表型（polymorphism phenotyping，POLYPHEN）分 值（http：／／genetics.bwh.harvard.edu／pph／pph＿help＿text.html）；選取在腦或周圍神經(jīng)系統(tǒng)有表達或?qū)?yīng)的分子功能有重要意義的基因變異優(yōu)先進行篩查。

1.5 Sanger測序驗證 針對突變位點設(shè)計引物，對該家系患者基因組DNA進行PCR擴增和Sanger測序，必要時對家系正常成員進行對照驗證。

2 結(jié)果

2.1 HB－Z177家系系普圖和聽力學(xué)特征 該家系系譜圖見圖1（正常成員的后代未畫出，也未納入統(tǒng)計），HB－Z177家系共五代合計27人（男13人，女14人），現(xiàn)存19人，主要為第三代至第五代成員，年齡介于15～60歲之間，共10人患雙耳感音神經(jīng)性聾，其中表型不確定者1人，現(xiàn)存確診患者7人。因時間久遠，已無法確定第一代患者性別；第二代共4名男性，患病2人，患病成員與正常成員比例為1：1；第三代1男3女共4人，有1男2女共3人患病，患病成員與正常成員比例為3：1，此比例偏離1：1，與該代成員數(shù)偏少有關(guān)；第四代4男5女共9人，有1男3女共4人患病，1人（IV11）表型不明確，患病成員與正常成員比例接近1：1；第五代共8人，1人患病，部分成員可能未到發(fā)病年齡。先證者（V2）26歲，于12歲左右開始出現(xiàn)聽力下降伴耳鳴，純音聽閾測試顯示雙耳對稱性中度至重度感音神經(jīng)性聾，聽閾曲線呈下降型（圖2f）。其余患者發(fā)病年齡不等，10～30歲出現(xiàn)聽力下降，且年齡均已超過45歲，均表現(xiàn)為雙耳對稱性進行性加重的重度感音神經(jīng)性聾，聽閾曲線雙耳對稱均為平坦型，第III7、IV1、IV3、IV5、IV7患者的純音聽閾圖見圖2a～e。由此可見，HB－Z177家系符合常染色體顯性遺傳性耳聾特征。

圖1 HB－Z177家系系譜圖

圖2 HB－Z177家系患者聽力圖

2.2 全外顯子組測序分析結(jié)果 總覽全外顯子組測序數(shù)據(jù)庫，平均測序深度及覆蓋度基本符合測序要求。單雜合的變異總數(shù)為936個，篩查到的已知耳聾基因的突變位點共6個（表1），根據(jù)上述篩選標準，因USH2A（rs3745079）在千人基因組中出現(xiàn)的頻率為0.037（≥0.001），TMIE（rs10578999）及DIAPH1（rs35249023）為STR，故均予以直接剔除；待篩查的已知致聾基因變異位點共3個，分別為EYA4（NM＿004100：c.1486A＞T）、MYO7A（NM＿000260：c.3602G＞C）和 ESPN（NM＿031475：c.2225C＞T）。剩余的可納入優(yōu)先考慮的候選SNV共234個，根據(jù)上述排除已知變異后的篩選標準，僅選取其中4個未知基因變異位點（表1）DNMT1（NM ＿001130823：c.4381C＞T）、BMP2（NM ＿001200：c.393A＞T）、TP63（NM＿001114979：c.854G＞A）及 RAI1（NM＿030665：c.4162G＞A）進行Sanger測序驗證。

2.3 Sanger測序結(jié)果 選取家系其余5名患病成員（III7，IV1，IV3，IV5，IV 7）及1名正常成員（IV8）應(yīng)用Sanger測序驗證，針對WES的初步篩選結(jié)果，依次完成了已知基因EYA4（NM＿004100：c.1486A＞T）、MYO7A（NM＿000260：c.3602G＞C）和 ESPN（NM＿031475：c.2225C＞T）的Sanger測序驗證，沒有發(fā)現(xiàn)這些堿基改變與臨床表型有共分離現(xiàn)象，予以排除。此篩查結(jié)果提示HB－Z177家系的遺傳性聾致病基因可能并非已知耳聾基因，而是由未知基因變異引起。后續(xù)對已知耳聾基因以外的DNMT1（NM＿001130823：c.4381C＞T）、BMP2（NM＿001200：c.393A＞T）、TP63（NM＿001114979：c.854G＞A）及 RAI1（NM＿030665：c.4162G＞A）進行了篩查，這些變異位點亦未與臨床表型共分離，亦予以排除。

表1 全外顯子組測序的6個已知耳聾基因突變位點及4個未知基因可疑變異的數(shù)據(jù)信息及篩查結(jié)果

3 討論

從文中結(jié)果看，HB－Z177家系第五代先證者V2與其他患病成員（III7、IV1、IV3、IV5、IV7）年齡差較大（V2與第三、四代患病成員年齡最小者IV7亦相差19歲），而V2現(xiàn)26歲，于12歲發(fā)病，表現(xiàn)為雙耳中重度感音神經(jīng)性聾，聽閾曲線呈下降型，其他患病成員均于10～30歲發(fā)病，現(xiàn)均已超過45歲，均表現(xiàn)為雙耳重度感音神經(jīng)性聾，聽閾曲線為平坦型，故僅能推測該家系耳聾發(fā)病初期可能以高頻聽力下降為主，是否隨年齡增長而進行性加重且逐漸累積全頻尚不可知；綜合其他患病成員的信息可明確，年齡超過45歲后，患者的聽閾曲線以平坦型為主，均表現(xiàn)為重度感音神經(jīng)性聾。該家系患病成員的發(fā)病年齡、聽力進行性加重的特點和均一對稱的聽閾曲線均提示其為遺傳性聾。從HB－Z177家系圖可知，該家系連續(xù)三代以上有成員發(fā)病，患病成員中5男5女，男女發(fā)病比例相等；第二代至第四代成員均達到發(fā)病年齡，除成員IV11外，表型均已明確，患者與正常人比例為9：7，患病成員與正常人比例接近，因第五代成員年齡介于15到26歲之間，可能有部分成員未到發(fā)病年齡而未出現(xiàn)表型，故此代患病成員與正常人比例為1：7，偏離1：1；正常成員后代均正常，患病成員父母均有1人患病。結(jié)合以上遺傳學(xué)分析可知，HB－Z177家系符合常染色體顯性遺傳非綜合征型感音神經(jīng)性聾特點。

千人基因組計劃為人們提供了豐富的人類遺傳變異數(shù)據(jù)［18］，為新一代測序技術(shù)的數(shù)據(jù)分析工作奠定了基礎(chǔ)。外顯子組測序高效、快捷，費用正逐步降低，且可實現(xiàn)目標區(qū)域的高覆蓋度，鑒于大多數(shù)的致病性變異主要位于編碼區(qū)或內(nèi)含子與外顯子相鄰區(qū)域，外顯子組測序已被廣泛地應(yīng)用到孟德爾遺傳性疾病研究中，大大地提升了變異的檢測效率。應(yīng)用WES研究家族遺傳性疾病，更有助于致病基因的快速篩選。HB－Z177家系僅選取1個樣本進行外顯子組測序，得到的數(shù)據(jù)量龐大，后期嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)分析工作對于致病基因的鑒定尤為重要。本家系為常染色體顯性遺傳，致病基因應(yīng)為雜合狀態(tài)，故剔除數(shù)據(jù)庫中的純合性變異；在所有的雜合性突變中，將已知的或已定位的致聾基因作為重點篩查對象，但剔除千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫、dbSNP數(shù)據(jù)庫已報道的出現(xiàn)頻率≥0.001的SNP及STR區(qū)域的變異，USH2A為Usher綜合征的已知致病基因，c.6683T＞A（NM＿206933）為 已 知 SNP（rs117461552），且在千人基因組中的頻率為0.0037（≥0.001），POLYPhen V2 分值較低，提示該變異對蛋白功能影響不大，暫不予以考慮；位于STR區(qū)域的TMIE（rs10578999）在千人基因組數(shù)據(jù)庫中，已明確其為非致病性變異；DIAPH1（rs35249023）亦位于STR，因STR區(qū)域較少出現(xiàn)致病性突變，故暫不考慮其致病的可能性，均予以剔除。對篩選出的3個已知致聾基因變異進行Sanger測序驗證，因沒有發(fā)現(xiàn)突變位點與臨床表型有共分離現(xiàn)象而予以全部排除。除以上所檢測的已知耳聾基因外，數(shù)據(jù)庫中未見其他雜合狀態(tài)的已知耳聾基因變異，此篩查結(jié)果提示該家系的致聾基因可能為未知基因。繼續(xù)按照以上的篩查策略，選擇在腦或周圍神經(jīng)系統(tǒng)等部位有表達或有重要功能的基因DNMT1、BMP2和TP63的對應(yīng)突變位點繼續(xù)篩查，以期找到家系的新致聾基因，但因堿基變異與耳聾表型未出現(xiàn)共分離現(xiàn)象予以排除。

本研究結(jié)果顯示，HB－Z177家系符合常染色體顯性遺傳規(guī)律，聽力學(xué)表現(xiàn)為雙側(cè)對稱的中度至重度感音神經(jīng)性聾。對外顯子組測序發(fā)現(xiàn)的3個已知耳聾基因突變位點及4個可疑的變異位點在家系其他成員進行Sanger測序驗證后，未發(fā)現(xiàn)這些突變堿基位點與耳聾表型共分離，提示其致聾基因可能為未知的新的致聾基因。本研究中，因單個樣品測序產(chǎn)生的基因數(shù)據(jù)信息量龐大，基因篩選工作的力度和難度較大，不利于致病基因的快速篩選，故擬進一步增加1～2個樣品行全外顯子組測序，以便快速鑒定出該家系的致聾基因。

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