王艷萍 錢 鑫 田 林 金 哲 (北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 0009)

宮頸癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而且近年來(lái)有年輕化的趨勢(shì)〔1〕。宮頸癌的發(fā)生和患者雜亂、過(guò)早、過(guò)多的性生活以及缺乏良好的衛(wèi)生習(xí)慣有關(guān)，但感染人類乳頭狀瘤病毒(HPV)是導(dǎo)致宮頸癌的最主要原因，目前部分學(xué)者認(rèn)為感染皰疹病毒型也能引起宮頸癌，但是該觀點(diǎn)沒(méi)有確定〔2，3〕。西醫(yī)治療主要是手術(shù)、放療、化療及新輔助化療的方法〔4〕，易造成機(jī)體免疫功能下降，甚至出現(xiàn)并發(fā)癥而導(dǎo)致死亡?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為辨證治療宮頸癌，通過(guò)整體觀念，把人體有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，調(diào)整人體的抗病能力，是治療腫瘤的重要環(huán)節(jié)。本文旨在研究中藥制劑清毒栓對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人宮頸癌Hela細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院。

1.1.2 藥物 中藥清毒栓由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院金哲教授惠贈(zèng);保婦康栓海南碧凱藥業(yè)有限公司。批號(hào):Z4602258

1.1.3 主要試劑與儀器 DMEM全培養(yǎng)液購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司;胎牛血清購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，胰酶及乙二胺四乙酸(EDTA):購(gòu)于 SERVA公司及賽多利斯公司;CCK-8試劑盒，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)均由(碧云天生物技術(shù)研究所);熒光顯微鏡 NiKon ECLIPSE，二氧化碳培養(yǎng)箱，均由(日本三樣電機(jī)株式會(huì)社制造);AN YANG超凈臺(tái)(蘇州安洋科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 中藥清毒栓及保婦康栓提純 將兩種中藥分別溶于10 ml水中，將溶液倒入分液漏斗中，分別加入三氯甲烷10 ml，溶液分為兩層，上層為水和蠟質(zhì)層，下層為氯仿和中藥的有效成分層，將下層置入約80℃水浴箱中蒸發(fā)，剩余物質(zhì)為中藥有效成分，放入4℃中保存待用。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)中藥清毒栓對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Hela細(xì)胞，加入 0.25%胰酶消化，離心1 500 r/min 5 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液為 1×104/ml，接種于96孔板(100 μl/孔)，將培養(yǎng)板置入5%CO2培養(yǎng)箱孵育，細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入 0.022 g/ml，0.011 g/ml，0.005 5 g/ml濃度的中藥清毒栓;保婦康栓濃度為0.035 g/ml，各加入15 μl/孔，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，終體積為200 μl，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，清毒栓高、中、低劑量組及保婦康栓組，置入5%CO2培養(yǎng)箱孵育，觀察在24 h時(shí)中藥清毒栓及保婦康栓對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的作用。在實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)加入20 μl CCK-8試劑，混勻。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光值(OD)〔5〕，波長(zhǎng)492 nm，記錄結(jié)果。

1.2.3 線粒體膜電位法檢測(cè)中藥清毒栓對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Hela細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化，離心1 500 r/min，5 min。細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種于六孔板(4.5×105/孔)，待細(xì)胞貼壁，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，清毒栓高、中、低劑量組及保婦康栓組，每孔加入不同濃度的清毒栓;濃度同1.2.2中，加入250 μl/孔，終體積為2 ml，設(shè)2個(gè)復(fù)孔，置入5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞1次，加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液。同時(shí)加入1 ml線粒體膜電位檢測(cè)試劑(JC-1)染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，將配置好的JC-1染色緩沖液(1X)放置于冰浴。37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌2次。加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液。熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，拍照。每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中所含的程序性死亡細(xì)胞數(shù)，取其均數(shù)計(jì)算細(xì)胞程序性死亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測(cè)中藥清毒栓對(duì)Hela細(xì)胞增殖作用的影響不同濃度的清毒栓對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞具有一定的抑制作用，并在24 h時(shí)作用最為明顯。清毒栓高劑量組(0.920±0.055)與保婦康栓組(0.737±0.038)、空白對(duì)照組(1.387±0.036)及清毒栓中、低劑量組(1.249±0.065)、(1.307±0.034)比較具有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 線粒體膜電位法檢測(cè)中藥清毒栓對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的作用 不同濃度的清毒栓對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞膜電位引起不同程度的下降，在24 h時(shí)作用最為明顯。保婦康栓組〔(56.16±0.096)%〕與空白組〔(22.52±0.062)%〕比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Hela活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，清毒栓高劑量組〔(55.74±0.096)%〕與 清 毒 栓 中、低 劑 量 組 〔(37.90±0.069)%、(34.74±0.078)%〕比較具有顯著性差異(P＜0.05)。熒光顯微鏡下可見(jiàn)，正常對(duì)照組細(xì)胞狀態(tài)良好，呈橘紅色熒光，胞漿著色深，可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，高劑量清毒栓組可見(jiàn)許多綠色熒光，少許橘紅色熒光。見(jiàn)圖2。

圖1 各組宮頸癌Hela細(xì)胞鏡下一次性給藥(×20)

圖2 各組Hela細(xì)胞線粒體膜電位鏡下一次性給藥(×20)

3 討論

研究表明，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系，細(xì)胞凋亡在維持多細(xì)胞生物機(jī)體穩(wěn)態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用〔6〕。

清毒栓為多年臨床用藥，主要成分為莪術(shù)、紫草、黃柏等，治療以辨病為主，抓住“毒邪結(jié)聚”這一病機(jī)關(guān)鍵，治法以攻毒散結(jié)，選用莪術(shù)破瘀消癥，其中莪術(shù)主要活性成分為B-欖香烯和莪術(shù)醇。其抗腫瘤的主要機(jī)制通過(guò)直接細(xì)胞毒作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡〔7〕。紫草以涼血解讀，活血散瘀，作為傳統(tǒng)中藥，其化學(xué)成分復(fù)雜，具有廣泛的藥理作用，抗腫瘤作用是其中之一。紫草提取物能抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡〔8〕。黃柏清熱燥濕，解讀消腫;黃柏具有抗病毒，提高免疫功能的功效。

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8檢測(cè)法，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性橙黃色的甲臜產(chǎn)物。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。CCK-8檢測(cè)法是一種綜合指標(biāo)較好的細(xì)胞活性檢測(cè)試劑，利用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活性的方法〔9〕，增加實(shí)驗(yàn)的可信度。結(jié)果表明中藥清毒栓可明顯抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，其中以高劑量抑制細(xì)胞增殖的作用比較明顯。

本研究采用線粒體膜電位檢測(cè)法，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下可現(xiàn)明顯的熒光反應(yīng)，Hela細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后僅呈現(xiàn)橘紅色熒光，若出現(xiàn)早期凋亡的Hela細(xì)胞會(huì)發(fā)出綠色熒光。線粒體膜電位測(cè)定結(jié)果表明中藥清毒可能通過(guò)降低線粒體膜電位抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。本研究結(jié)果為中藥清毒栓對(duì)宮頸癌的防治提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為更深步的探討抗腫瘤機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。

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