馮留偉，李鐵強，侯俊清

巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一種廣泛表達的細胞因子，其生物學功能多樣，包括先天性與獲得性免疫反應(yīng)中的促炎作用、抑制糖皮質(zhì)激素、調(diào)節(jié) NK 細胞免疫功能、參與細胞增殖與生存、細胞遷移、DNA損傷和細胞周期調(diào)控等[1]；MIF 在急性和慢性炎癥病理過程中也發(fā)揮著重要作用，如感染性休克、風濕性關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化等。此外，大量研究證實 MIF 在多種腫瘤中高表達，而與其緊鄰的非癌細胞中 MIF 表達無明顯增加[2]。但 MIF 與膀胱尿路上皮癌之間關(guān)系的報道甚少。本研究采用免疫組織化學法和 Western bolt 方法，分析 MIF 在膀胱尿路上皮癌中的表達特征及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 膀胱癌標本 來源于河南大學淮河醫(yī)院2006年泌尿外科手術(shù)病例 75 例（隨訪至術(shù)后5年），均經(jīng)組織病理學檢查，確診為膀胱尿路上皮癌，切緣組織中未見癌組織浸潤，術(shù)前均未經(jīng)任何治療。其中包括 50 名男性，25 名女性，年齡范圍 39～84 歲，平均年齡（66.8 ± 5.3）歲。組織離體后立即放置 –86 ℃ 冰箱中低溫保存。

1.1.2 主要試劑 免疫組化 ABC 試劑盒為美國Vector Laboratories 公司產(chǎn)品；兔抗 MIF多克隆抗體為美國 Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品；生物素標記山羊抗兔二抗、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑購自中衫金橋公司；PVDF 為美國 Millipore公司產(chǎn)品；ECL購自康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 Power PACTMHC 型電泳儀及Trans-Blot SD?cell 電轉(zhuǎn)系統(tǒng)為美國伯樂公司產(chǎn)品；顯微鏡及 TS100 成像系統(tǒng)為日本 Nikon 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學 膀胱尿路上皮癌及癌旁組織經(jīng) 10% 多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，切片厚度 4～5 μm。石蠟切片于 70 ℃ 烤箱烘烤30 min、二甲苯脫蠟 10 min、過梯度酒精（100%、90%、80%、70%），EDTA 法修復(fù)，2% 羊血清封閉 20 min。2% BSA 作為稀釋一抗（鼠源性單克隆抗 MIF 抗體，1∶100），4 ℃ 孵育過夜。生物素化二抗（羊抗鼠，1∶200）孵育 1 h。DAB 顯色 5 min、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。同時對照組的一抗用 PBS 代替。

結(jié)果判定：MIF 蛋白以細胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。首先根據(jù)全部組織中腫瘤細胞染色的陽性細胞所占總細胞的比例進行評分。在低倍視野下，陽性細胞所占比例小于 10% 為 0 分，10%～ 25% 為 1 分，25%～50% 為 2 分，50%～75%為 3 分，大于 75% 為 4 分。再根據(jù)免疫染色強度進行第二次評分，陰性為 0 分，弱陽性為 1 分，中度陽性為 2 分，強陽性為 3 分。最后將 2 次得到的評分相乘即為最終所得到的免疫組化評分，滿分為 12 分。

1.2.2 Western blot 選取 TNM I～IV 期膀胱尿路上皮癌及手術(shù)切緣組織各 10 對，共 40 例。取200 mg 組織，按比例加入組織蛋白裂解液，冰上勻漿 10 min，于 4 ℃、12000×g 離心 5 min，吸取上清，置于 –80 ℃ 保存。用 BCA 法測定總蛋白濃度，在 15% SDS-PAGE 上電泳，蛋白上樣量為 50 μg。電泳完畢后使用電轉(zhuǎn)儀將樣品轉(zhuǎn)印至PVDF 膜。5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h；以鼠源性單克隆抗 MIF 抗體（1∶5000）為一抗，室溫孵育2 h 或 4 ℃ 過夜。1×PBS 洗 3 次，每次 10 min，以山羊抗鼠 HRP-IgG（1∶2500）為二抗，室溫孵育1 h，ECL 顯色后暗室曝光，膠片掃描，圖像處理分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

將得到的免疫組化評分進行統(tǒng)計學分析。使用SPSS17.0 分析軟件，各組間的分析采用 t 檢驗，患者預(yù)后分析采用 Kaplan-Meier 曲線和 Log-rank檢驗分析，患者生存時間統(tǒng)計標準為手術(shù)時間開始到死亡時間或者統(tǒng)計終止時間，以 P ≤ 0.05 為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 Western b1ot 結(jié)果

40例膀胱鱗癌中，MIF 陽性表達的百分率為72.5%（29/40），部分 Western blot 結(jié)果如圖 1A 所示。在 TNM I、II、III、IV 期膀胱尿路上皮癌中，MIF 高（過）表達的百分率分別為 50%（5/10）、70%（7/10）、80%（8/10）、90%（9/10），即隨著臨床分期的增加，其在膀胱尿路上皮癌組織中高表達比例逐漸增加（圖 1B）。與此相應(yīng)，手術(shù)切緣組織中 MIF 的表達量亦逐漸降低。此外，經(jīng)統(tǒng)計學分析，TNM I 期 和 IV 期 MIF 陽性表達的差異具有顯著的統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

2.2 免疫組織化學法檢測結(jié)果

圖1 Western blot 結(jié)果Figure1 Western blot result

圖2 MIF 在膀胱正常上皮（A）、高分化癌（B）和低分化癌（C）中的表達情況Figure2 MIF expression in normal uroepithelial (A), well-differentiated uroepithelial cancer (B), poorly-differentiated uroepithelial cancer (C)

表1 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌臨床病理資料的相關(guān)性Table1 Relationship between MIF expression and clinicopathological features of uroepithelial cancer in bladder

MIF 在膀胱尿路上皮癌中的陽性表達率是78.6%（59/75），著色主要位于細胞膜，如圖 2 所示。結(jié)果表明，MIF在高、中、低分化的膀胱尿路上皮癌中高（過）表達的百分率分別為 42%、52.8%、59.3%。分析 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌 TNM分期的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn) MIF 在 TNM I、II、III、IV 期膀胱尿路上皮癌中高（過）表達的百分率分別為60%、68%、73%、100%，且 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌的臨床分期有統(tǒng)計學意義（I 期 + II 期與III 期 + IV 期相比，P < 0.05）。MIF 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和陰性的膀胱尿路上皮癌中高（過）表達的百分率分別為 66.7%、36.4%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。然而，MIF 的表達與膀胱尿路上皮癌浸潤深度、性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大體類型無差異（表 1）。

2.3 Kap1an-Meier 生存分析

應(yīng)用 Kaplan-Meier 生存分析法分析 MIF 表達與膀胱尿路上皮癌患者生存時間的相關(guān)性。圖 3顯示 MIF 高表達的膀胱尿路上皮癌患者生存期顯著縮短（P = 0.0341），表明 MIF 的表達越高預(yù)示著患者生存時間越短，預(yù)后相對較差；相反，MIF表達較低的患者，其生存時間則較長。此外，Kaplan-Meier 生存分析法分析其他臨床資料與膀胱尿路上皮癌患者的生存關(guān)系，表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期與膀胱尿路上皮癌患者生存期顯著縮短呈正相關(guān)，而年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤類型、浸潤深度與膀胱尿路上皮癌患者生存期無關(guān)。

圖3 MIF 的表達情況與膀胱尿路上皮癌患者生存期的關(guān)系（P = 0.0341）Figure3 Correlation between MIF expression and patients with uroepithelial cancer of bladder (P = 0.0341)

3 討論

惡性腫瘤的形成和發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟的極其復(fù)雜的緩慢過程，多數(shù)惡性腫瘤患者確診時已發(fā)展至中晚期，治療措施及效果有限，是導致惡性腫瘤患者高死亡率的根本原因之一。早期診斷和治療能夠明顯提高惡性腫瘤患者的治愈率，降低死亡率，延長患者生存時間。因此，近年來的研究熱點之一是尋找惡性腫瘤早期診斷的生物標志物，以便早期發(fā)現(xiàn)腫瘤、徹底治愈[3]。

MIF 是一個分子量為 12.5 kD 的炎癥因子，在急性和慢性炎癥的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，如感染性休克、風濕性關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化等[4]。除此之外，MIF 在多種癌癥中表達水平明顯升高，包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤等[5]。不僅如此，MIF 的表達水平還與多種腫瘤患者的生存期密切相關(guān)，提示 MIF 可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。因此，MIF 可能是炎癥反應(yīng)與腫瘤發(fā)生的紐帶，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用。利用 MIF 拮抗性抗體或基因沉默技術(shù)敲低 MIF 表達可導致細胞增殖減慢，抑制腫瘤生長和血管生成，間接影響腫瘤的生長和發(fā)展進程。Piette 等[7]報道，MIF 參與人肺腺癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。Rendon 等[4]和 Ren 等[8]研究報道，MIF 在膠質(zhì)母細胞瘤和前列腺癌的生長和侵襲中也發(fā)揮著重要作用。

本研究通過免疫組織化學法和 Western blot方法驗證了 MIF 在膀胱尿路上皮癌及邊緣組織中的表達規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MIF 在膀胱尿路上皮癌中的陽性表達百分率為 78.6%（59/75），而在正常尿路上皮中均無表達，且與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，與患者生存時間負相關(guān)。這表明，MIF可能是膀胱尿路上皮癌變多階段演進過程中的重要變化分子。

膀胱尿路上皮癌惡性程度越高，腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移能力越強。本研究也表明，隨著膀胱尿路上皮癌惡性程度增加，MIF 在其中的表達量也顯著增加（P< 0.05）。因此，我們推測 MIF 可能是膀胱尿路上皮癌早期診斷和預(yù)后判斷的重要生物標志之一。

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