解曉露，魏東，王國治，黃長江

宮頸癌是一種在全世界范圍內(nèi)死亡率僅次于乳腺癌的女性癌癥，并且相對來說常見于年輕女性，是最常見的惡性腫瘤之一。在發(fā)展中國家婦女中，其發(fā)病率居第一位。70% 的宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）16 型和 18 型引起的，其中 16 型與宮頸癌關(guān)系最為密切[1]。此外，研究發(fā)現(xiàn) HPV16 型也與人類其他癌癥有關(guān)，如喉癌、食管癌、骨髓癌等[2]。最近的研究顯示，HPV16 型是中國西南部最流行的高危血清感染型之一[3]。為了防治 HPV16 的感染從而有效控制相關(guān)腫瘤的發(fā)生，高效 HPV16 疫苗的研制日益成為研究熱點(diǎn)。目前，世界上有兩種 HPV VLPs 疫苗上市，均采用真核表達(dá)系統(tǒng)，分別是Merck 的表達(dá)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的 Gardasil[4]和GSK 的源于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的 Cervarix[5]，這兩種疫苗的制備工藝復(fù)雜，價(jià)格昂貴，在發(fā)展中國家難以普及，而發(fā)展中國家又是宮頸癌患病率和死亡率高發(fā)的國家，所以研制出價(jià)格低廉的宮頸癌疫苗迫在眉睫。本研究在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，高效制備 HPV16L1 VLPs，用以制備經(jīng)濟(jì)的 HPV16 預(yù)防性疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 限制型內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA 凝膠回收試劑盒、抽提質(zhì)粒試劑盒均購自日本 Takara 公司；蛋白分子量標(biāo)記購自美國 Thermo 公司；HPV16L1 單克隆抗體購自美國GeneTex 公司；羊抗鼠 IgG 購自中杉金橋公司。AKTA 層析系統(tǒng)和層析介質(zhì)均為美國 GE 公司產(chǎn)品；透射電鏡 H-7650 為日本日立公司產(chǎn)品。

1.1.2 載體和感受態(tài)細(xì)胞 PET30a 原核表達(dá)載體、PMD-18T 克隆載體和大腸桿菌（E.coil）DH5α、Rosetta(DE3)均為本室保存。

1.2 方法

1.2.1 重組非融合表達(dá)質(zhì)粒 PET30a-HPV16L1的構(gòu)建

1.2.1.2 HPV16L1 的擴(kuò)增和表達(dá)質(zhì)粒 PET30a-HPV16L1 的構(gòu)建 以宮頸癌患者陰道分泌物中提取的 DNA 為模板，用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行 HPV16L1基因的 PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行回收純化，連接到PMD-18T 載體上，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。正確無誤后雙酶切 PMD-18T- HPV16L1重組質(zhì)粒和 PET30a 載體，在 T4 DNA 連接酶的作用下，16 ℃ 連接過夜，轉(zhuǎn)化宿主菌 DH5α，挑陽性克隆提取質(zhì)粒測序。

1.2.2 序列優(yōu)化后的表達(dá)質(zhì)粒 PET30a-HPV16L1的構(gòu)建 在不改變氨基酸密碼的前提下，按照大腸桿菌密碼偏愛性對 1.2.1.2 擴(kuò)增出的 HPV16L1 基因進(jìn)行優(yōu)化合成，基因兩端分別加入 Nde I 和Hind III 酶切位點(diǎn)，基因優(yōu)化和合成工作由Invitrogen 公司完成，得到 PMK-RQ-HPV16L1 重組質(zhì)粒。

Nde I/Hind III 雙酶切處理 PMK-RQ-HPV16L1重組質(zhì)粒，從瓊脂糖凝膠中切下目的條帶，回收后獲得 HPV16L1 基因片段，將其與經(jīng)過同樣處理的PET30a 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌 DH5α，在含卡那霉素的 LB 培養(yǎng)板上隨機(jī)挑取菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行 Nde I/Hind III 雙酶切鑒定，并對陽性克隆測序。

1.2.3 HPV16L1 的表達(dá) 取序列優(yōu)化前后的重組質(zhì)粒 PET30a-HPV16L1 分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)Rosetta(DE3)，將 Rosetta(DE3) 轉(zhuǎn)化菌接種到含有卡那霉素和氯霉素雙抗性 LB 培養(yǎng)基中，于 37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將培養(yǎng)物按 1∶100 的比例轉(zhuǎn)接于 1 L 不含抗性的 LB 中，繼續(xù)在 37 ℃ 搖床培養(yǎng)至 OD600值達(dá)到 0.6 時(shí)，加入 IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，25 ℃ 誘導(dǎo) 8 h。離心收集菌體沉淀，用 1×PBS 洗滌菌體，稱量菌體計(jì)算菌體濕重，按 20 ml 裂解液/g 濕重進(jìn)行高壓均質(zhì)破碎處理，離心獲得菌體裂解上清和沉淀。將上述表達(dá)過程中留取樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，分析目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 HPV16L1 的純化 菌體裂解上清過 0.45 μm孔徑濾膜后作為樣品，直接在蛋白純化儀上進(jìn)行Macrocap SP 陽離子交換層析純化，含 500 mmol/L NaCl 的緩沖液洗脫雜蛋白，含 900 mmol/L NaCl的緩沖液洗脫目的蛋白。洗脫的目的蛋白用低鹽緩沖液稀釋一倍后，直接作為樣品進(jìn)行肝素-Sepharose FF 親和層析，以含 500 mmol/L NaCl 的緩沖液洗脫目的蛋白。純化過程中留取樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，分析蛋白純化效果。

1.2.5 純化產(chǎn)物的 Western blot 分析 將純化蛋白 HPV16L1 進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含 BSA 的封閉液封閉過夜，依次用 HPV16L1 單克隆抗體（1∶10000 稀釋）及羊抗鼠 IgG-HRP（1∶20000）室溫孵育 2 h，DAB 顯色試劑盒顯色并拍照。

1.2.6 HPV16L1 及其降解蛋白的液相-質(zhì)譜鑒定 將純化后的 HPV16L1 蛋白及其降解蛋白切膠送至中科院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組研究分析中心進(jìn)行液相-質(zhì)譜鑒定。

1.2.7 透射電鏡觀察 VLPs 取少量純化后的蛋白原液，銅網(wǎng)孵育 10 min，1% 磷鎢酸（pH 7.0）負(fù)染 5 min，在 30000 倍下觀察純化產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 HPV16L1 擴(kuò)增

將測序結(jié)果經(jīng) Blast 發(fā)現(xiàn)與 HPV16（序列號K02718）L1 基因序列相似度為 99%，與谷鴻喜等[6]在中國婦女宮頸癌組織中擴(kuò)增出的 HPV16L1基因完全一致。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

Nde I/Hind III 雙酶切重組質(zhì)粒 PET30a-HPV16L1 的雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見兩條帶，一條約 1500 bp，為 16L1 基因，一條約 5000 bp，為 PET30a 載體（圖 1），重組質(zhì)粒經(jīng)測序與理論序列完全一致，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 HPV16L1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Figure1 Restrictive enzyme digestion analysis of HPV16L1 recombinant plasmid

2.3 HPV16L1 的誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白形態(tài)的鑒定

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE 分析，序列優(yōu)化后的Rosetta(DE3) 工程菌誘導(dǎo)后有一條特異性的蛋白條帶：約 55 kD，大小與預(yù)期一致，而序列優(yōu)化前的工程菌誘導(dǎo)后幾乎沒有目的蛋白的表達(dá)（圖 2），表明序列優(yōu)化使目的蛋白在原核系統(tǒng)中獲得了高效表達(dá)。

圖2 HPV16L1的誘導(dǎo)表達(dá)Figure2 Induction of HPV16L1 expression

高壓均質(zhì)破菌后發(fā)現(xiàn)上清中目的蛋白的表達(dá)量很高，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的高效可溶性表達(dá)（圖3），使用 Quantity one v462 軟件對目的蛋白可溶性表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示目的蛋白約占總蛋白的 38%。

圖3 HPV16L1 的可溶性表達(dá)情況Figure3 Soluble expression of HPV16L1 protein

2.4 HPV16L1 的純化

純化后的蛋白經(jīng) SDS-PAGE 分析有兩條蛋白帶，一條約 55 kD，為目的蛋白，一條約 45 kD，為降解蛋白（圖 4）。

圖4 純化蛋白的 SDS-PAGE 分析Figure4 Analysis of purified protein by SDS-PAGE

2.5 HPV16L1 蛋白的 Western b1ot 分析

將純化后的蛋白進(jìn)行 Western blot 分析，在約55 kD 和 45 kD 處出現(xiàn)兩條特異性條帶（圖 5），表明純化后的蛋白是 HPV16L1 蛋白及其降解蛋白。

圖5 Western blot 檢測 HPV16L1 純化產(chǎn)物Figure5 Detection of HPV16L1 purification by Western blot

2.6 HPV16L1 及其降解蛋白的液相-質(zhì)譜鑒定

液相-質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示 2 個(gè)樣品覆蓋率分別為 56% 和 63%，均為 HPV16L1 蛋白，即分子量為 55 kD 左右的蛋白為目的蛋白，45 kD 左右的蛋白為降解蛋白。

2.7 HPV16L1 透射電鏡觀察

透射電鏡觀察純化后的 HPV16L1 蛋白原液，視野中含有大量直徑約為 50 nm 的球狀顆粒，顆粒的大小和形態(tài)均與天然的病毒樣顆粒一致（圖6）。

圖6 透射電鏡下觀察 HPV16L1 VLPs（× 30000）Figure6 Observation of HPV16L1 VLPs by transmission electron microscope (× 30000)

3 討論

原核表達(dá)系統(tǒng)是一種成熟完善的基因克隆表達(dá)系統(tǒng)，其繁殖迅速，培養(yǎng)簡單，操作方便，遺傳穩(wěn)定，成本低廉，生產(chǎn)率高，表達(dá)的外源蛋白對人無感染性，具有生物安全性高，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)有大量文獻(xiàn)報(bào)道在大腸桿菌中表達(dá)的HPV16L1 蛋白可以在體外自我組裝 VLPs[7]，因此，本研究選用原核表達(dá)系統(tǒng)來制備 VLPs。但是其表達(dá)時(shí)常出現(xiàn)可溶性表達(dá)量低、易形成包涵體等現(xiàn)象，這成為研究者面臨的一大難題。國內(nèi)外研究往往通過硫酸銨沉淀法來濃縮可溶性蛋白[8]，或者進(jìn)行包涵體表達(dá)和純化[7]，抑或是添加 GST 等助溶標(biāo)簽[9]。但是，硫酸銨沉淀法并不能從本質(zhì)上解決問題，同時(shí)從工業(yè)生產(chǎn)的角度來說，生產(chǎn)率低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；包涵體表達(dá)量可觀但純化蛋白過程中必須經(jīng)過變性和復(fù)性，復(fù)性率的高低和純化后蛋白的活性都很難有保證；添加助溶標(biāo)簽雖可大大提高可溶性蛋白表達(dá)量，但后期很難將標(biāo)簽完全切除，殘留的標(biāo)簽蛋白可能會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生潛在危害。因此為了提高目的蛋白的可溶性表達(dá)，本研究進(jìn)行了包括密碼子偏好性、密碼子使用頻率、RNA 二級結(jié)構(gòu)、GC 含量等一系列優(yōu)化[10-11]，結(jié)果顯示序列優(yōu)化效果顯著，大幅度提高了目的蛋白的可溶性表達(dá)，為高效制備 HPV16L1 VLPs 奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究在 HPV16L1 蛋白的純化上與魏旻希等[8]有顯著差別：首先，在純化過程中沒有加入任何變性劑和還原劑（如尿素、DTT 等），使目的蛋白維持其天然構(gòu)象，采用直接純化 HPV16L1 VLPs，省去了去除還原劑 DTT，誘導(dǎo) HPV16L1 重新組裝成 VLPs 的過程，結(jié)果顯示純化產(chǎn)物在電鏡下觀察為直徑是 50 nm 左右的形態(tài)與天然病毒顆粒高度相似的 VLPs，說明在原核系統(tǒng)中，HPV16L1也可以自發(fā)形成 VLPs，這與 HPV16L1 在真核系統(tǒng)中自我組裝成 VLPs 相一致，對后期進(jìn)行大腸桿菌來源的 HPV VLPs 與已上市的來自真核系統(tǒng)的VLPs 疫苗的免疫原性比較的研究有重要意義。其次，在純化步驟上進(jìn)行適當(dāng)簡化，省去了硫酸銨沉淀法，兩步層析方法純化 HPV16L1 VLPs，第一步選用 Macrocap SP 填料，這是一種專門為大分子和大顆粒物質(zhì)設(shè)計(jì)的陽離子交換填料，直接純化了破菌上清液中 HPV16L1 VLPs，純化效率較高；第二步選用的肝素親和層析也是一種特異性純化HPV16L1 VLPs 的方法[12]，經(jīng)過兩步純化后，蛋白純度大于 95%。總之，本研究簡化了純化步驟，直接純化出了 HPV16L1 VLPs，更有利于工業(yè)化。

HPV16L1 蛋白純化過程中，在 SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示在分子量為 45 kD 左右有一條蛋白帶，Western blot 結(jié)果顯示，該蛋白與 HPV16L1 單克隆抗體有特異性免疫反應(yīng)，同時(shí)液相-質(zhì)譜鑒定該蛋白是 HPV16L1 的降解蛋白，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的在大腸桿菌中表達(dá)的 L1 蛋白極易降解的結(jié)果相一致[13-14]。L1 蛋白的磷酸化和糖化都很弱，且磷酸化半衰期很短，僅 60 min，120 min 后磷酸化基本消失[15]，這可能是蛋白降解的主要原因。提示我們在進(jìn)行 HPV16L1 蛋白的純化過程中，實(shí)驗(yàn)溫度必須控制在較低溫度下，而且盡量避免反復(fù)凍融，以及操作過程中加入某些蛋白酶抑制劑。

本實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌中高效表達(dá)并純化了HPV16 L1 蛋白，同時(shí)對純化產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步的研究，將純化產(chǎn)物置于 4 ℃，通過進(jìn)行SDS-PAGE 電泳來觀察純化產(chǎn)物的穩(wěn)定性，結(jié)果在將近 1 個(gè)月的時(shí)間內(nèi)仍維持 95% 以上，說明純化產(chǎn)物的穩(wěn)定性較高，具有重要的臨床應(yīng)用意義，對于純化產(chǎn)物的長期穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)室會(huì)繼續(xù)進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步制備經(jīng)濟(jì)型宮頸癌預(yù)防性疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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