劉虹，謝瓊，李勇枝，薛春美，王靜，王佳平

Tribbles 同源基因 3（tribbles homolog 3，TRB3）是果蠅 tribbles 基因的哺乳動(dòng)物同源基因，在嚙齒類動(dòng)物中亦被稱為神經(jīng)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)假激酶（neuronal cell death-inducible putative kinase，NIPK）基因[1]。TRB3 蛋白具有廣泛的生物學(xué)功能，在多條信號(hào)通路中充當(dāng)了限制性的角色，并且在胚胎發(fā)育和癌癥、自身免疫性疾病、糖尿病等人類疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[2]。最新的研究表明，TRB3 與纖維化疾病密切相關(guān)：纖維化的主要病理改變是組織間膠原的過(guò)度沉積，Tang 等[3]發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中，TRB3 可以差異性調(diào)節(jié)多種膠原的表達(dá)，可以增加 I 型膠原的含量，同時(shí)抑制 III 型膠原的表達(dá)。在纖維化發(fā)生的過(guò)程中，成纖維細(xì)胞是I 型膠原的主要生產(chǎn)者[4]，而目前并沒(méi)有關(guān)于TRB3 調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞中膠原含量的報(bào)道。

腺病毒載體的外源基因裝載量大、表達(dá)外源基因效率高，可以感染多種組織或細(xì)胞，且容易制得高滴度病毒載體。腺病毒載體進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，安全性高。因而，腺病毒載體是繼反轉(zhuǎn)錄病毒載體之后，應(yīng)用范圍最廣泛且最具前景的病毒載體。因此，本文中使用pAdEasy-1 腺病毒載體，構(gòu)建了過(guò)量表達(dá)小鼠TRB3 的腺病毒系統(tǒng)。

在本研究中，我們使用腺病毒系統(tǒng)在小鼠成纖維細(xì)胞中過(guò)量表達(dá) TRB3，檢測(cè)成纖維細(xì)胞中 I 型膠原及 III 型膠原的含量，發(fā)現(xiàn) TRB3 的表達(dá)可以差異性地調(diào)節(jié) I 型膠原與 III 型膠原的含量。這一結(jié)果為闡明纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展提供了一定的指導(dǎo)意義，為治療纖維化疾病提供了新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 3T3-NIH 細(xì)胞及 HEK293 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞培養(yǎng)中心。3T3-NIH 細(xì)胞使用 DMEM 培養(yǎng)基，10% FBS培養(yǎng)。HEK293 細(xì)胞使用 IMDM 培養(yǎng)基，10% FBS培養(yǎng)。每隔 2 天傳代一次，細(xì)胞培養(yǎng)條件為 37 ℃，5% CO2。

1.1.2 主要試劑 DMEM、IMDM 細(xì)胞培養(yǎng)基、進(jìn)口血清 FBS 和胰酶購(gòu)于美國(guó) Gibco 公司；pEASY- T1 simple 載體、TransScript 反轉(zhuǎn)錄酶和高保真 DNA 合成酶購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA 連接酶、Pme I、Pac I 限制性內(nèi)切酶購(gòu)于美國(guó) NEB 公司；Trizol、Lipofectine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó) Invitrogen 公司；pADEasy-1 腺病毒表達(dá)系統(tǒng)購(gòu)于德國(guó) Merck 公司；小量腺病毒純化提取試劑盒購(gòu)于德國(guó) Biomega 公司；天狼猩紅染色試劑盒購(gòu)于英國(guó) Biocolor 公司；抗小鼠TRB3 購(gòu)于美國(guó) Sigma-Aldrich 公司，抗小鼠β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó) Cell-Signaling Technology公司；I、III 型膠原抗體購(gòu)于英國(guó) Abcam 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度定量試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 TRB3 目的基因的克隆 針對(duì)小鼠 TRB3基因序列（NM_175093.2）設(shè)計(jì)引物，第一輪引物為 5' AGGACAAGATGCGAGCTAC 3'，5' CTGTTC ACAGCACCTAGAGC 3'。提取小鼠肝臟的 RNA，反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA 作為模板，進(jìn)行 PCR，退火溫度為 57 ℃，延長(zhǎng)時(shí)間為 1 min，40 個(gè)循環(huán)。以第一輪測(cè)序正確的 PCR 產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪PCR，添加酶切位點(diǎn)。選擇 Sal I、Hind III 為酶切位點(diǎn)，進(jìn)行第二輪 PCR，5' ACGCGTCGACGACAA GATGCGAGCTACAC 3'，5' CCCAAGCTTCTAGCC GTACAGCCCC 3'，退火溫度為 58 ℃，延長(zhǎng)時(shí)間為1 min，40 個(gè)循環(huán)。將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后，連接至 pEASY- T1 simple 載體，進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 TRB3 腺病毒的構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[5]的方法，將測(cè)序正確的 TRB3 序列連接至 pTrack-CMV質(zhì)粒中，然后使用 Pme I 限制性內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行線性化，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌 BJ5183 中進(jìn)行同源重組。在 37 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后，選擇較小的克隆搖菌提取質(zhì)粒，使用 Pme I 內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，選擇鑒定正確的陽(yáng)性重組子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 TRB3 腺病毒的包裝 參考文獻(xiàn)[5]的方法，將重組質(zhì)粒使用 Pac I 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化后，轉(zhuǎn)染進(jìn) HEK293 細(xì)胞中進(jìn)行腺病毒的包裝。培養(yǎng) 24 h 后換液，培養(yǎng)皿中可見(jiàn)到約 10% 的熒光，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后可見(jiàn)到“彗星”樣熒光，第7 天補(bǔ)加 3 ml 培養(yǎng)基，到第 12 天細(xì)胞有 80%脫落時(shí)，去除培養(yǎng)上清，加入 3 ml 新鮮的完全培養(yǎng)基收集細(xì)胞。

1.2.4 TRB3 腺病毒的擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)[5]的方法，將細(xì)胞置于 37 ℃ 5 min 后，置于 –80 ℃ 5 min，反復(fù)凍融 3 次，1140×g、4 ℃ 離心 5 min，棄去細(xì)胞碎片，將上清使用 0.22 μm 的濾器過(guò)濾，將1 ml 凍融液加入到細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行新一輪的病毒擴(kuò)增。72 h 后，待細(xì)胞有 80% 脫落時(shí)，收集細(xì)胞，將其置于 37 ℃ 5 min 后，置于 –80 ℃5 min 條件下，反復(fù)凍融 3 次。繼續(xù)下一輪的擴(kuò)增。反復(fù) 5 輪擴(kuò)增之后，收集所有的病毒凍融液進(jìn)行純化。

1.2.5 TRB3 腺病毒純化 按照說(shuō)明書(shū)的操作步驟，使用小量腺病毒純化提取試劑盒進(jìn)行純化，將凍融的混合物 1140×g、4 ℃ 離心 10 min，取上清，用 0.45 μm 濾膜過(guò)濾。將過(guò)濾的病毒上清液加入到平衡好的硅膠純化柱中，柱子垂直插入冰盒，依靠重力使上清液通過(guò)純化柱。再加入 5 ml 漂洗緩沖液洗滌純化柱兩次，向柱子中加入 5 ml 平衡緩沖液。洗脫后將洗脫液裝入處理好的透析袋中，放入滅菌預(yù)冷的 PBS（pH 7.4）中，4 ℃ 低溫室透析 8～10 h，中間更換 PBS 一次；使用 0.22 μm 的濾器過(guò)濾透析后的病毒液，取 50 μl 用于測(cè)定滴度，其余病毒放入 –80 ℃ 保存。

1.2.6 TRB3 腺病毒滴度測(cè)定 以 TCID50法在96 孔板中測(cè)定腺病毒的滴度。將 HEK293 細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，每孔種 5×103個(gè)細(xì)胞以及 150 μl 的10% FBS 培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)滿 90% 以上，更換新的 10% FBS 培養(yǎng)基，每孔加入使用培養(yǎng)基梯度稀釋的病毒液，梯度設(shè)置如下：10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，每個(gè)梯度設(shè)置 5 個(gè)孔，另設(shè)一排細(xì)胞不加病毒作為對(duì)照，培養(yǎng) 5 d 后觀察熒光。以觀察該孔是否有熒光為主，是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)為輔，有熒光反應(yīng)及有細(xì)胞病變的孔確定為陽(yáng)性孔，最后按照Reed-Muench method 公式計(jì)算病毒滴度。

1.2.7 Western blot 取適量培養(yǎng)細(xì)胞，加入 RIPA裂解液后振蕩混勻，冰上放置 30 min，間或振蕩；4 ℃、4560×g，離心 15 min。取上清，使用蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，其具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。調(diào)節(jié)蛋白至相同濃度，分裝，加入 5 倍上樣緩沖液，96 ℃ 變性 10 min，一部分用于 SDS 電泳，一部分 –80 ℃ 保存[6]；使用 Amersham 顯色系統(tǒng)顯色，經(jīng) Western blot 印跡分析軟件測(cè)出各條帶的光密度值并分析[7]。

1.2.8 天狼猩紅染色檢測(cè) I 型膠原 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]的方法，收集細(xì)胞后，4 ℃、600×g 離心20 min 后取上清，按照膠原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)膠原含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TRB3 目的基因克隆及載體構(gòu)建

以小鼠肝臟為模板，進(jìn)行 PCR 克隆 TRB3 基因序列，將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 DNA 瓊脂糖凝膠電泳，得到 1200 bp 左右的條帶，符合 TRB3 目的基因的大小（圖 1A），經(jīng)測(cè)序鑒定得到序列正確的質(zhì)粒。使用雙酶切，將得到的 TRB3 目的片段插入到 pTrack-CMV 的多克隆位點(diǎn)中，得到含有 TRB3目的片段的載體 TRB3-CMV，將其與空載體pTrack-CMV 共同進(jìn)行 DNA 瓊脂糖凝膠電泳，TRB3-CMV 的分子量大于空載體（圖 1B），說(shuō)明TRB3-CMV 構(gòu)建成功。

圖1 TRB3 電泳結(jié)果（A：TRB3 基因 PCR 結(jié)果；B：TRB3-CMV 電泳結(jié)果）Figure1 The electrophoresis results of TRB3 (A: PCR results of TRB3; B: Electrophoresis results of TRB3-CMV)

2.2 TRB3 腺病毒的包裝

將重組后的、帶有 TRB3 目的基因的腺病毒載體（Ad-TRB3）使用 Pac I 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，將線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)染進(jìn) HEK293 細(xì)胞中，于 37 ℃細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，進(jìn)行病毒顆粒的包裝，當(dāng)病毒包裝完畢后可以見(jiàn)到少量的綠色熒光（圖 2A）。

2.3 TRB3 腺病毒的滴度測(cè)定

圖2 轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá) TRB3 腺病毒質(zhì)粒的倒置熒光圖片（A：轉(zhuǎn)染后 24 h；B：轉(zhuǎn)染后 72 h）Figure2 The inverted fluorescence photo of overexpressed TRB3 adenovirus (A: Infecting for 24 h; B: Infecting for 72 h)

使用小量腺病毒純化提取試劑盒對(duì)擴(kuò)增后的病毒進(jìn)行純化并測(cè)定腺病毒的滴度，按照 Reed-Muench method 公式計(jì)算病毒滴度，計(jì)算結(jié)果為107.625TCID50/ml（表 1）。將純化完畢的病毒再次感染 HEK293 細(xì)胞后，觀察綠色熒光的表達(dá)，此時(shí)綠色熒光明顯增多，表明腺病毒滴度增加（圖 2B）。

2.4 鑒定 TRB3 腺病毒的表達(dá)效果

將帶有 TRB3 目的基因的腺病毒感染 HEK293細(xì)胞后，使用 PCR 的方法檢測(cè) TRB3 的表達(dá)，結(jié)果顯示，TRB3 的 mRNA 水平要明顯高于正常HEK293 細(xì)胞以及感染對(duì)照載體 Ad-Track 腺病毒的 HEK293 細(xì)胞（圖 3A）。將帶有 TRB3 目的基因的腺病毒感染 HEK293 細(xì)胞后，使用 Western blot 的方法檢測(cè) TRB3 的表達(dá)，結(jié)果顯示感染Ad-TRB3 腺病毒的 HEK293 細(xì)胞中，TRB3 的蛋白表達(dá)水平要明顯高于正常 HEK293 細(xì)胞及感染對(duì)照載體 Ad-Track 腺病毒的 HEK293 細(xì)胞（圖3B），以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明使用 Ad-TRB3 可以過(guò)量地表達(dá) TRB3。

2.5 過(guò)量表達(dá) TRB3 促進(jìn) 3T3-NIH 細(xì)胞中膠原的分泌和表達(dá)

將帶有 TRB3 目的基因的腺病毒 Ad-TRB3感染小鼠成纖維細(xì)胞 3T3-NIH 細(xì)胞后，使用天狼猩紅染色的方法檢測(cè) 3T3-NIH 細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原的含量，結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清中膠原的含量顯著增加，說(shuō)明過(guò)量表達(dá) TRB3 可以顯著地促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌膠原（圖 4A）。Western blot 法檢測(cè)TRB3 以及 I 型膠原的表達(dá)，結(jié)果顯示在感染過(guò)量表達(dá) TRB3 的腺病毒后，TRB3 的表達(dá)顯著增加，同時(shí) I 型膠原的表達(dá)顯著增加，III 型膠原的表達(dá)顯著下降（圖 4B）。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，過(guò)量表達(dá) TRB3 可以增加成纖維細(xì)胞中 I 型膠原的分泌和表達(dá)，同時(shí)降低 III 型膠原的表達(dá)。

表1 按照 Reed-Muench method 公式計(jì)算病毒滴度Table1 Calculating the virus drops according to the formula of Reed - Muench method

圖3 使用腺病毒載體過(guò)量表達(dá) TRB3（A：PCR 檢測(cè) TRB3 mRNA 水平；B：Western blot 檢測(cè) TRB3 蛋白水平）Figure3 The expression of TRB3 is increased in the HEK293 cells infected the adenovirus (A: Detecting the mRNA of TRB3 by PCR; B: Detecting the expression of TRB3 by Western blot)

3 討論

TRB3 是哺乳動(dòng)物 Tribbles 家族三個(gè)成員（TRB1、TRB2、TRB3）中研究得最為清楚的一個(gè)，TRB3 在 PI3/Akt、BMP、MAPK 和 ATF4/CHOP通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及調(diào)控中起到了重要的作用[2]。在糖尿病性心肌病中，AGEs 可以誘導(dǎo) I 型膠原的產(chǎn)生，抑制 III 型膠原的產(chǎn)生，同時(shí)誘導(dǎo) TRB3 的表達(dá)增加；此外，當(dāng)抑制 ERK 和 p38-MAPK 后，再給予 AGEs 的刺激，I 型膠原表達(dá)下降，而 III型膠原表達(dá)升高；當(dāng)使用 siRNA 抑制 TRB3 的表達(dá)后，給予 AGEs 的刺激可以使 I 型膠原表達(dá)下降，而 III 型膠原表達(dá)升高[3]。因此，在糖尿病性心肌病中，TRB3/MAPK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)了 I 型和III 型膠原的產(chǎn)生。以上的研究說(shuō)明，TRB3 可以通過(guò)調(diào)節(jié)膠原的含量，參與組織纖維化的發(fā)生發(fā)展。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，增加 TRB3 的表達(dá)可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞中 I 型膠原的表達(dá)和分泌，降低 III 型膠原的含量，進(jìn)一步支持了以上的研究結(jié)果。

腺病毒載體理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，能很容易獲得高滴度病毒系，可達(dá) 1011～1012pfu/ml，比反轉(zhuǎn)錄病毒高 104倍[8]。同時(shí)，腺病毒感染率高，既能感染復(fù)制狀態(tài)的細(xì)胞，又能感染非復(fù)制狀態(tài)的細(xì)胞[9]，復(fù)制缺陷型腺病毒是目前感染率最高的病毒，質(zhì)粒和反轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染率都遠(yuǎn)低于 0.1%，腺病毒體外血管內(nèi)皮細(xì)胞感染效率達(dá) 100%，體內(nèi)感染率可達(dá) 15%～80%，以相同外源基因?yàn)榛鶞?zhǔn)，腺病毒的感染效率是質(zhì)粒的 140000 倍[10]。且腺病毒載體可以容納較大的外源性 DNA 片段（8 kb 左右）[11]，腺病毒載體的細(xì)胞毒性較低，應(yīng)用比較安全[12]。因此，在本研究中構(gòu)建了過(guò)量表達(dá) TRB3 的腺病毒載體，并且在小鼠成纖維細(xì)胞系 3T3-NIH 中，探討過(guò)量表達(dá) TRB3 后對(duì)于成纖維細(xì)胞分泌膠原的影響。

圖4 過(guò)量表達(dá) TRB3促進(jìn) 3T3-NIH細(xì)胞 I 型膠原的分泌（A：天狼猩紅染色法檢測(cè)膠原含量；B：Western blot 法檢測(cè)TRB3、I 型膠原及 III 型膠原的表達(dá)）Figure4 Overexpression of TRB3 could promote the secretion of type I collagen in mouse fibroblasts cell (A: Detecting the collagen by Sirius red staining; B: Detecting the expression of TRB3, collagen I and collagen III by Western blot)

我們?cè)谘芯恐袑⑿∈?TRB3 基因插入腺病毒載體穿梭質(zhì)粒的 E1 區(qū)中，構(gòu)建了攜帶小鼠 TRB3基因的重組腺病毒 Ad-TRB3，采用兩個(gè)相同效率的啟動(dòng)子分別啟動(dòng) TRB3 和 GFP 兩個(gè)基因，從而使得 TRB3 和 GFP 兩個(gè)外源蛋白同比例地高效表達(dá)，從而合成具有高效生物活性的 TRB3。而且該重組腺病毒不僅 E1 基因缺失，而且 E3 基因也缺失，使得其毒性更加降低，因而使用時(shí)更加安全可靠。本實(shí)驗(yàn)通過(guò) PCR、Western blot 等分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)，均證明構(gòu)建的 Ad-TRB3 是能夠高效表達(dá) TRB3 的，并具有很高的病毒滴度。

綜上所述，使用腺病毒系統(tǒng)在小鼠成纖維細(xì)胞中過(guò)量表達(dá) TRB3 可以促進(jìn) I 型膠原的表達(dá)與分泌，降低 III 型膠原的表達(dá)，說(shuō)明 TRB3 可以差異性調(diào)節(jié)膠原的含量。這一研究結(jié)果為探討 TRB3促進(jìn)纖維化發(fā)生提供了新的研究方向，進(jìn)一步明確了 TRB3 可以作為治療纖維化疾病發(fā)生的潛在靶點(diǎn)。

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