劉瀏，周在威，馬晴雯

鏈霉菌噬菌體 ΦC31 整合酶可介導(dǎo)鏈霉菌attB 位點(diǎn)與哺乳動(dòng)物基因組假 attP 位點(diǎn)之間的重組，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的位點(diǎn)特異性整合[1]。然而，整合會(huì)將載體中的細(xì)菌骨架帶入基因組，造成安全隱患[2]。微環(huán) DNA 是一種缺乏抗性標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)等細(xì)菌序列的小環(huán)超螺旋分子，有著較高的生物安全性和轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率[3]。除傳統(tǒng)的阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶表達(dá)介導(dǎo)其識(shí)別位點(diǎn)重組獲得微環(huán)DNA 的方法外[4-6]，LR 克隆酶[7-8]也被用于微環(huán)DNA 的制備[9]。但該方法同樣需要在重組后將微環(huán)DNA 回收純化，操作煩瑣，得率也不甚理想。為避免上述問題，本文聯(lián)合應(yīng)用 LR 克隆酶和 ΦC31整合酶系統(tǒng)，建立了一種高效、快速獲得位點(diǎn)特異整合型微環(huán) DNA 的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒 人宮頸癌細(xì)胞系 HeLa 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；質(zhì)粒 pEGFP-N1-attB[10]和 pcDNA3.1(-)-P1A3-TPO[11]由本所構(gòu)建保存；表達(dá)噬菌體 ΦC31 整合酶的質(zhì)粒 pPGKPhiC31obpA[12]購于美國 Addgene公司（Plasmid No.13795）；大腸桿菌 E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 主要試劑 LR 克隆酶、DMEM 培養(yǎng)液、血清及 PBS 均購自美國 Life Technologies 公司，引物及 λattL 和 λattR 也由該公司合成；GenJet?Plus 轉(zhuǎn)染試劑購自美國 SignaGen 公司；限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA 連接酶購自美國 NEB 公司；SYBR?熒光定量 PCR 試劑購自日本 Takara 公司；hTPO ELISA 試劑盒購自美國 R & D 公司；PCR 純化試劑盒和膠回收試劑盒購自德國 Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的獲得 將合成的 λattL 和 λattLrc單鏈（分別含有限制性內(nèi)切酶 Afl III 和 Ase I 黏性末端，序列見表 1）干粉配制為 100 μmol/L 的溶液后等物質(zhì)的量混合，置于 100 ℃ 沸水中待其自然冷卻，即得到 λattL 雙鏈。同樣方法獲得兩端分別為 Spe I 和 Dra III 限制性酶切位點(diǎn)黏性末端的 λattR 雙鏈。

以限制性內(nèi)切酶 Pvu II 和 Spe I 分別酶切質(zhì)粒 pPGKPhiC31obpA 和 pcDNA3.1(-)-P1A3-TPO，電泳切膠回收含有 ΦC31 整合酶表達(dá)盒和 hTPO基因的目的片段。

1.2.2 親本質(zhì)粒的構(gòu)建 在 pEGFP-N1-attB 質(zhì)粒（GFP 組對(duì)照質(zhì)粒，簡寫為 pEGFP-C）的 Spe I和 Dra III 酶切位點(diǎn)之間插入 λattR 片段，在Afl III 和 Ase I 酶切位點(diǎn)之間插入 λattL 片段，獲得質(zhì)粒 pEGFP-N1-attB-λattR-λattL 后，在其 Afl III酶切位點(diǎn)處插入 ΦC31 整合酶表達(dá)盒，獲得pEGFP-N1-attB-λattR-λattL-ΦC31Int 親本質(zhì)粒，簡寫為 pEGFP-PP。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

限制性內(nèi)切酶 BamH I 和 Not I 雙酶切親本質(zhì)粒 pEGFP-PP，去除 EGFP 后使載體自連。隨后在該載體 Nhe I 酶切位點(diǎn)處插入 hTPO，獲得目的基因?yàn)?hTPO 的親本質(zhì)粒 pTPO-attB-λattR-λattLΦC31Int，簡寫為 pTPO-PP。采用同樣方法，將質(zhì)粒 pEGFP-N1-attB-λattR-λattL 中的 EGFP 替換為hTPO，獲得 pTPO-attB-λattR-λattL，作為 hTPO 組的對(duì)照質(zhì)粒，簡寫為 pTPO-C。

1.2.3 LR 重組反應(yīng) 在 LR 克隆酶作用下，親本質(zhì)粒 pEGFP-PP 和 pTPO-PP 發(fā)生重組反應(yīng)，形成微環(huán) DNA 和微質(zhì)粒（圖 1）。LR 重組反應(yīng)體系為：親本質(zhì)粒 200 ng、10×TE 緩沖溶液 1 μl、LR克隆酶 2 μl、加 ddH2O 至 10 μl。反應(yīng)條件：25 ℃，4 h。

1.2.4 轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞 將 HeLa 細(xì)胞消化傳代至 12 孔板，于細(xì)胞匯合度為 80%～90% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參照轉(zhuǎn)染試劑 GenJet? Plus 說明書進(jìn)行。主要步驟如下：移除培養(yǎng)液，以 PBS 沖洗細(xì)胞2 遍，加入 600 μl 無血清 DMEM 培養(yǎng)液。然后配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物：在 1.5 ml EP 管內(nèi)加入 DNA 混合物，以無血清 DMEM 補(bǔ)足 50 μl，混勻。實(shí)驗(yàn)組 DNA 混合物為未純化的 LR 重組體系 10 μl和 4 倍于微環(huán) DNA 物質(zhì)的量的 pPGKPhiC31obpA質(zhì)粒。對(duì)照組 DNA 混合物為與微環(huán) DNA 等物質(zhì)的量的對(duì)照質(zhì)粒和 5 倍于對(duì)照質(zhì)粒物質(zhì)的量的pPGKPhiC31obpA 質(zhì)粒。因?qū)嶒?yàn)組 LR 重組產(chǎn)物中含有與微環(huán) DNA 等物質(zhì)的量的表達(dá) ΦC31 整合酶的微質(zhì)粒，故上述實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組 DNA 混合物中微環(huán) DNA 及對(duì)照質(zhì)粒的物質(zhì)的量與 ΦC31整合酶質(zhì)粒物質(zhì)的量比值均為 1∶5。在另一 1.5 ml EP 管中按照 DNA（μg）∶轉(zhuǎn)染試劑（μl）為 1∶3 的比例加入 GenJet? Plus 轉(zhuǎn)染試劑，以無血清DMEM 補(bǔ)足 50 μl，混勻。將上述轉(zhuǎn)染試劑稀釋液加入 DNA 混合物中，輕輕吹打混勻，室溫靜置20 min 后，將 100 μl 轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入 12 孔板中，輕輕搖勻。另設(shè)不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染 12 h 后，換新鮮的含血清 DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

圖1 LR重組反應(yīng)示意圖Figure1 Schematic diagram of LR recombination

1.2.5 LR 重組效率測(cè)定 以 EcoR I 酶切pEGFP-PP 的 LR 重組產(chǎn)物來鑒定重組反應(yīng)的發(fā)生：若發(fā)生重組，則微環(huán) DNA（pEGFP-MC）和微質(zhì)粒分別被線性化，得到約 2.0 和 5.3 kb 兩條帶；若未發(fā)生重組，則親本質(zhì)粒被切成約 1.2 和6.1 kb 兩條帶。以 PvuⅡ 酶切驗(yàn)證 pTPO-PP 的LR 重組：若發(fā)生重組，則能切出約 2.7 kb（pTPOMC）和 5.3 kb（微質(zhì)粒）兩條帶；若未發(fā)生重組，則能切出約 1.9 和 6.1 kb 兩條帶?？赏ㄟ^觀察電泳圖中各條帶亮度粗略判斷 LR 重組效率。

此外，應(yīng)用熒光定量 PCR 方法檢測(cè)各質(zhì)粒的拷貝數(shù)可較為精確地計(jì)算 LR 重組效率。在親本質(zhì)粒 λattR 兩端設(shè)計(jì)引物 MC-F 和 λattR-R（序列見表 1）擴(kuò)增該質(zhì)粒的特有片段，檢測(cè)親本質(zhì)粒的拷貝數(shù)；同時(shí)，設(shè)計(jì)引物 MP-F 和 MP-R（序列見表 1）擴(kuò)增 LR 重組反應(yīng)前后拷貝數(shù)不變的片段，作為定量 PCR 內(nèi)參。以 ddH2O 替代 LR 重組反應(yīng)體系中的 LR 克隆酶作為 LR 重組反應(yīng)前樣品。將兩組親本質(zhì)粒 pEGFP-PP 和 pTPO-PP LR重組反應(yīng)前后樣品分別稀釋 100 倍和 1000 倍進(jìn)行熒光定量 PCR，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行絕對(duì)定量，比較 LR 重組反應(yīng)前后親本質(zhì)粒的拷貝數(shù)，獲得LR 克隆酶的重組效率。計(jì)算公式如下：

另外，也可以通過鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中整合載體是否為微環(huán) DNA 來判斷 LR 重組反應(yīng)的效率。LR重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)染 2 周后，獲取 27 個(gè) GFP 陽性單克隆細(xì)胞基因組 DNA 用于 PCR 鑒定。在形成微環(huán)DNA 的 λattL 和 λattR 兩端分別設(shè)計(jì)引物 MC-F和 MC-R（序列見表 1），若為微環(huán) DNA 整合，則可擴(kuò)增得到 119 bp 的條帶。同時(shí)，以引物對(duì)EGFP-F 和 EGFP-R（序列見表 1）檢測(cè)上述克隆中 EGFP 基因的整合（擴(kuò)增產(chǎn)物長度為 585 bp）。重組效率計(jì)算公式如下：

1.2.6 轉(zhuǎn)染率及整合率測(cè)定 pEGFP-MC 和pEGFP-C 轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞 24 h 后，分別接種 1 ×104個(gè)細(xì)胞至 3 個(gè) 10 cm 培養(yǎng)皿，剩余細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光細(xì)胞比例，作為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染率。接種于培養(yǎng)皿中的細(xì)胞不再傳代，僅換液處理，待第 14 天后熒光鏡檢統(tǒng)計(jì)皿中 GFP 陽性細(xì)胞單克隆數(shù)，計(jì)算整合率。計(jì)算公式如下：

1.2.7 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) pEGFP-MC 和pEGFP-C 轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞 14 d 后，挑取pEGFP-MC 轉(zhuǎn)染組 23 個(gè)微環(huán) DNA 整合 GFP陽性細(xì)胞單克隆和 pEGFP-C 轉(zhuǎn)染組 8 個(gè) GFP陽性細(xì)胞單克隆，將這些克隆化細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)達(dá)到一定數(shù)量后，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞克隆的綠色熒光強(qiáng)度，評(píng)估 GFP 目的蛋白的表達(dá)水平。

pTPO-MC 和 pTPO-C 轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞 48 h后，收集各孔培養(yǎng)液，并接種 1×105個(gè)細(xì)胞至新的 12 孔板中，保持每孔 DMEM 培養(yǎng)液體積均為 1 ml；隨后每 2.5 天收集一次培養(yǎng)液并將 1 ×105個(gè)細(xì)胞接種傳代，直至轉(zhuǎn)染后第 29.5 天。應(yīng)用 hTPO ELISA 試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)收集的培養(yǎng)液中 hTPO 蛋白表達(dá)水平。操作步驟按照 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組轉(zhuǎn)染率、整合率的測(cè)定及 GFP 和 hTPO 蛋白表達(dá)水平比較均采用方差分析，以 P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LR 重組效率鑒定結(jié)果

酶切鑒定電泳結(jié)果顯示，重組體系中微環(huán) DNA和微質(zhì)粒的條帶亮度明顯高于親本質(zhì)粒（圖 2A），直觀地表明 LR 重組效率較高。

熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果可見，由兩組親本質(zhì)粒 pEGFP-PP 和 pTPO-PP 的兩個(gè)稀釋梯度得出LR 重組效率為 82.56% ± 0.76%（表 2）。

圖2 LR 克隆酶重組效率鑒定Figure2 Identification of the LR recombination efficiency

表2 熒光定量 PCRa 檢測(cè) LR 重組效率Table2 LR recombination efficiency detected by real-time PCRa

GFP 陽性細(xì)胞克隆中 LR 重組片段 PCR 鑒定結(jié)果表明，隨機(jī)挑選的 27 個(gè) GFP 陽性細(xì)胞單克隆中有 23 個(gè)為微環(huán) DNA 整合（圖 2B、圖2C），即 LR 克隆酶重組效率為 85.19%（23/27），與熒光定量 PCR 結(jié)果一致。

2.2 轉(zhuǎn)染率的測(cè)定結(jié)果

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，微環(huán) pEGFP-MC 的轉(zhuǎn)染率顯著高于傳統(tǒng)質(zhì)粒 pEGFP-C，為其 3.66 倍（24.80% ± 10.21% vs.6.77% ± 1.61%，P = 0.039，3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，圖 3A）。

2.3 整合率的測(cè)定結(jié)果

轉(zhuǎn)染 2 周后，克隆計(jì)數(shù)并計(jì)算外源基因在細(xì)胞基因組中的整合率。結(jié)果顯示，微環(huán)pEGFP-MC和傳統(tǒng)質(zhì)粒 pEGFP-C 的整合率分別為 0.82% ±0.11% 和 0.52% ± 0.07%（圖 3B）。雖然微環(huán) DNA的整合率僅為傳統(tǒng)質(zhì)粒的 1.58 倍，但兩者相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P = 0.014，3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。

2.4 蛋白表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果

圖3 微環(huán)轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率、整合率及目的蛋白表達(dá)水平（A：微環(huán) DNA 及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；B：微環(huán) DNA 及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞的整合率；C：微環(huán) DNA 及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞的 GFP 蛋白表達(dá)水平；D：微環(huán) DNA 及對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞的 hTPO 蛋白表達(dá)水平）Figure3 Transfection efficiency, integration rate, and protein expression level of genes in the minicircle DNA (A: Transfection efficiency of minicircle DNA; B: Integration rate of minicircle DNA; C: GFP expression level of minicircle DNA; D: hTPO expression level of minicircle DNA)

以流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng) PCR 鑒定為微環(huán) DNA整合的 23 個(gè)細(xì)胞克隆以及對(duì)照組 pEGFP-C 整合的 8 個(gè)細(xì)胞克隆的 GFP 熒光強(qiáng)度，分別為（958.60 ± 328.11）和（137.99 ± 83.46）（圖 3C），前者為后者的 6.95 倍，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P <0.001）。

此外，ELISA 檢測(cè) pTPO-MC 和 pTPO-C 在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)期 hTPO 的表達(dá)水平，結(jié)果如圖 3D所示。轉(zhuǎn)染 2、4.5、7、9.5 d 時(shí)，微環(huán) pTPO-MC組 hTPO 蛋白表達(dá)水平均明顯高于傳統(tǒng)質(zhì)粒組，前者為后者的 4～12 倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.05，3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。然而，pTPO-MC 轉(zhuǎn)染組和 pTPO-C轉(zhuǎn)染組分別在轉(zhuǎn)染后第 14.5 天和第 12 天收集的培養(yǎng)液上清中即無法檢測(cè)到目的蛋白 hTPO 的表達(dá)。

3 討論

ΦC31 整合酶系統(tǒng)可介導(dǎo)含鏈霉菌 attB 位點(diǎn)及外源基因的質(zhì)粒載體整合于哺乳動(dòng)物基因組的假 attP 位點(diǎn)處。序列特征分析表明，假 attP 位點(diǎn)與野生型 attP 位點(diǎn)有一定的序列相似性，且多位于基因間或內(nèi)含子區(qū)域[13]。因此，外源基因在假attP 位點(diǎn)處的整合使得靶細(xì)胞基因組被破壞的風(fēng)險(xiǎn)明顯低于隨機(jī)整合，安全性有所提高。此外，由于該系統(tǒng)介導(dǎo)的目的基因整合后具有較好的表達(dá)水平，因而在基因治療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[14]。但上述整合會(huì)將質(zhì)粒載體上的細(xì)菌骨架序列也帶入基因組，仍然存在安全隱患[2]。

微環(huán) DNA 是由傳統(tǒng)質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)通過位點(diǎn)特異性重組將其抗性標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等細(xì)菌序列刪除而得到的一種小環(huán)超螺旋分子，具有較高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和安全性[3]。經(jīng)典的微環(huán)DNA 制備方法是以阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)，重組酶介導(dǎo)其識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生重組，形成含細(xì)菌骨架的微質(zhì)粒和含目的基因表達(dá)盒的微環(huán) DNA，微環(huán)DNA 必須與微質(zhì)粒分離才能得到進(jìn)一步的應(yīng)用[3]。近年來，微環(huán) DNA 的制備方法得到了多種改進(jìn)[9,15]。與傳統(tǒng)采用阿拉伯糖誘導(dǎo)方法不同的是，Tasic 等[9]成功地利用 LR 克隆酶在體外反應(yīng)中獲得了微環(huán) DNA。

然而，經(jīng)典的阿拉伯糖誘導(dǎo)方法[16]和采用 LR克隆酶制備微環(huán) DNA 時(shí)[9]，為將微環(huán) DNA 與微質(zhì)粒分離，需要酶切消化微質(zhì)粒和殘留親本質(zhì)粒、純化回收微環(huán) DNA 等操作，微環(huán) DNA 的產(chǎn)率很低。雖然優(yōu)化的阿拉伯糖誘導(dǎo)法的微環(huán) DNA 產(chǎn)率有所提高[15]，但其需要特定的工程菌株。

為避免上述問題，本文聯(lián)合應(yīng)用 LR 克隆酶和ΦC31 整合酶系統(tǒng)，結(jié)合兩個(gè)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)，建立了一種獲得位點(diǎn)特異整合型微環(huán) DNA 的方法：借助LR 克隆酶將細(xì)菌骨架序列刪除后，利用 ΦC31 整合酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)目的基因的位點(diǎn)特異性整合。由于在利用 ΦC31 整合酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)外源基因位點(diǎn)特異整合時(shí)，必須將含有 attB 位點(diǎn)和目的基因的質(zhì)粒與表達(dá) ΦC31 整合酶的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染[14]，因此本文在構(gòu)建親本質(zhì)粒時(shí)在微質(zhì)粒部分連入了 ΦC31整合酶表達(dá)盒，使該微質(zhì)粒在后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中可被有效利用，而無需與微環(huán) DNA 分離。該親本質(zhì)粒經(jīng) LR 重組后獲得的微環(huán) DNA 與表達(dá) ΦC31整合酶的微質(zhì)粒的物質(zhì)的量之比為 1∶1。我們的研究表明，在含 attB 位點(diǎn)質(zhì)粒物質(zhì)的量固定的情況下，共轉(zhuǎn)染表達(dá) ΦC31 整合酶質(zhì)粒的物質(zhì)的量越高，整合效率越高（兩者比例在 1∶1～1∶50 的范圍內(nèi)，未發(fā)表數(shù)據(jù)）。因此，為保證實(shí)驗(yàn)中目的質(zhì)粒有較高的整合效率，本文在將 LR 重組反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞的同時(shí)，額外加入 4 倍于微環(huán) DNA 的表達(dá) ΦC31 整合酶的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，使含 attB 位點(diǎn)質(zhì)粒與表達(dá)整合酶質(zhì)粒的物質(zhì)的量之比達(dá)到 1∶5（與對(duì)照組一致）。實(shí)驗(yàn)表明，LR 克隆酶可高效介導(dǎo)親本質(zhì)粒的 LR 重組，微環(huán) DNA 的產(chǎn)率達(dá)到 80% 以上，產(chǎn)物中微環(huán)DNA 與殘留親本質(zhì)粒的物質(zhì)的量之比為（4.38 ±0.44），是優(yōu)化的阿拉伯糖誘導(dǎo)方法[15]的近 3 倍（4.38/1.51，P < 0.001）。且該 LR 重組產(chǎn)物無需純化，可直接轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞系，避免了回收過程中的損失，大大減少了實(shí)驗(yàn)操作步驟和時(shí)間。未來可嘗試對(duì) LR 重組反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，如 LR 克隆酶分批加入、增加 LR 克隆酶用量以及延長反應(yīng)時(shí)間等，盡可能提高微環(huán) DNA 的產(chǎn)率，減少殘留親本質(zhì)粒的含量。

ELISA 及流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)質(zhì)粒相比，微環(huán) DNA 轉(zhuǎn)染組的目的蛋白 GFP 和hTPO 均呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)狀態(tài)，這可能與微環(huán)DNA 具有較高的轉(zhuǎn)染率以及不含細(xì)菌骨架序列有關(guān)[17]。然而，微環(huán) pTPO-MC 在轉(zhuǎn)染后第 14.5 天收集的培養(yǎng)液上清中即無法檢測(cè)到目的蛋白 hTPO的表達(dá)。這可能是由于微環(huán) DNA 不含真核篩選基因，細(xì)胞在未加壓傳代生長過程中，整合外源基因的細(xì)胞逐漸被具有生長優(yōu)勢(shì)的未整合細(xì)胞淹沒[18]，使得目的蛋白表達(dá)不斷降低直至消失。相比之下，由于以 GFP 為目的基因的微環(huán)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞在低密度培養(yǎng)過程中未進(jìn)行傳代處理，因此不存在上述與 hTPO 表達(dá)類似的現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染 14 d 后仍可觀察到 GFP 表達(dá)。隨后的 GFP 陽性細(xì)胞克隆化培養(yǎng)結(jié)果表明，克隆化操作是獲得穩(wěn)定整合并表達(dá)目的基因細(xì)胞克隆的有效途徑。因此，未來可聯(lián)合應(yīng)用其他重組酶系統(tǒng)，如 Cre/loxP 系統(tǒng)以及 FLP/FRT系統(tǒng)，在構(gòu)建親本質(zhì)粒時(shí)將兩端有同向重組酶識(shí)別序列的真核篩選基因連接入微環(huán) DNA 部分，藥物篩選獲得目的細(xì)胞后，誘導(dǎo)重組酶表達(dá)刪除篩選基因，有望實(shí)現(xiàn)安全、高效、無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因。

總之，本文聯(lián)合利用 LR 克隆酶和 ΦC31 整合酶建立了一種獲得位點(diǎn)特異整合型微環(huán)DNA 的方法，為微環(huán) DNA 作為轉(zhuǎn)基因操作的理想載體奠定了良好的基礎(chǔ)。

[1] Calos MP.The phiC31 integrase system for gene therapy.Curr Gene Ther, 2006, 6(6):633-645.

[2] Oliveira PH, Mairhofer J.Marker-free plasmids for biotechnological applications - implications and perspectives.Trends Biotechnol, 2013,31(9):539-547.

[3] Mayrhofer P, Schleef M, Jechlinger W.Use of minicircle plasmids for gene therapy.Methods Mol Biol, 2009, 542:87-104.

[4] Bigger BW, Tolmachov O, Collombet JM, et al.An araC-controlled bacterial cre expression system to produce DNA minicircle vectors for nuclear and mitochondrial gene therapy.J Biol Chem, 2001, 276(25):23018-23027.

[5] Chen ZY, He CY, Ehrhardt A, et al.Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.Mol Ther, 2003, 8(3):495-500.

[6] Jechlinger W, Azimpour Tabrizi C, Lubitz W, et al.Minicircle DNA immobilized in bacterial ghosts: in vivo production of safe non-viral DNA delivery vehicles.J Mol Microbiol Biotechnol, 2004, 8(4):222-231.

[7] Landy A.Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.Annu Rev Biochem, 1989, 58:913-949.

[8] Hartley JL, Temple GF, Brasch MA.DNA cloning using in vitro site-specific recombination.Genome Res, 2000, 10(11):1788-1795.

[9] Tasic B, Hippenmeyer S, Wang C, et al.Site-specific integrasemediated transgenesis in mice via pronuclear injection.Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(19):7902-7907.

[10] Ma QW, Sheng HQ, Yan JB, et al.Identification of pseudo attP sites for phage phiC31 integrase in bovine genome.Biochem Biophys Res Commun, 2006, 345(3):984-988.

[11] Liu Y, Yan JB, Wang Q, et al.Construction and expression of tissue-specific vectors expressing human thrombopoietin gene in the mammary gland.J Med Mol Biol, 2007, 4(4):283-288.(in Chinese)劉茵, 嚴(yán)景斌, 王強(qiáng), 等.人血小板生成素基因乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá).醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 2007, 4(4):283-288.

[12] Raymond CS, Soriano P.High-efficiency FLP and PhiC31 site-specific recombination in mammalian cells.PLoS One, 2007,2(1):e162.

[13] Chalberg TW, Portlock JL, Olivares EC, et al.Integration specificity of phage phiC31 integrase in the human genome.J Mol Biol, 2006,357(1):28-48.

[14] Karow M, Calos MP.The therapeutic potential of ΦC31 integrase as a gene therapy system.Expert Opin Biol Ther, 2011, 11(10):1287-1296.

[15] Kay MA, He CY, Chen ZY.A robust system for production of minicircle DNA vectors.Nat Biotechnol, 2010, 28(12):1287-1289.

[16] Chen ZY, He CY, Kay MA.Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.Hum Gene Ther,2005, 16(1):126-131.

[17] Chen ZY, He CY, Meuse L, et al.Silencing of episomal transgene expression by plasmid bacterial DNA elements in vivo.Gene Ther,2004, 11(10):856-864.

[18] Roberts PE, Mather JP.Introduction to cell and tissue culture.New York: Plenum Press, 1998:77-78.