巢 偉，張桂紅，徐 雷

(湖南中岸生物藥業(yè)有限公司，長沙410100)

乙型腦炎(Japanese Encephalitis，JE)又稱流行性乙型腦炎、日本乙型腦炎，簡稱乙腦，是由乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的致人和動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的人畜共患急性傳染病。豬是主要宿主及傳染源，人成為間接宿主，乙腦病毒形成豬—蚊—人的傳播循環(huán)。因此，乙型腦炎的防治研究不但對(duì)于豬的規(guī)?；B(yǎng)殖有重要的意義，而且有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。1988年，我國開始生產(chǎn)原代地鼠腎細(xì)胞乙腦減毒活疫苗(SA14－14－2株)，與乙腦滅活疫苗相比，抗體陽轉(zhuǎn)率較高，接種針次少，副反應(yīng)明顯降低。目前，該疫苗是我國廣泛使用的乙腦疫苗，累積接種人數(shù)超過1.5億［1］。獸用乙腦活疫苗的應(yīng)用，在國內(nèi)從七十年代起，將人醫(yī)選育乙型腦炎減毒株5－3株用于豬，2－8株用于馬。由于兩毒株各自的缺陷及其它原因，在九十年代以后停用。受SA14－14－2減毒株十多年來在我國大面積推廣用于人群的成功經(jīng)驗(yàn)，擬將SA14－14－2株作為豬用乙腦弱毒株，進(jìn)行了一系列試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 試劑和細(xì)胞 三價(jià)熒光抗體(牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒(BVDV/MD)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬瘟病毒(HCV))、綠猴腎(Vero)傳代細(xì)胞、PK15傳代細(xì)胞，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。流行性乙型腦炎特異性抗血清、乙腦強(qiáng)毒P3株(腹腔接種10～12 g小鼠半數(shù)致死量≥107.5LD50)，由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腦診斷試劑盒由北京生物制品研究所提供。原代地鼠腎細(xì)胞、牛睪丸細(xì)胞、0.2%紅細(xì)胞懸液(豚鼠紅細(xì)胞、人“O”型紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞等量混合)，本公司實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 乙腦抗體陰性的后備母豬(體重60～70 kg)、妊娠30日健康易感初懷母豬及4～8日齡健康易感乳豬，本公司健康動(dòng)物房提供。SPF級(jí)小鼠由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.3 基礎(chǔ)種子批 豬乙型腦炎病毒SA14－14－2疫苗株F5代、F6代、F7代凍干毒種，病毒含量分別為 107.8TCID50/mL、107.6TCID50/mL、107.7TCID50/mL，本公司種毒室制備。

1.4 外源病毒檢測

1.4.1 檢驗(yàn)用原代細(xì)胞制備 用10～14日齡的SPF地鼠和1～4日齡健康小公牛，按常規(guī)方法制備地鼠腎原代細(xì)胞、牛睪丸細(xì)胞。分裝于25 mL的方瓶，置37℃培養(yǎng)，長滿單層后備用。

1.4.2 豬乙型腦炎凍干毒種與乙型腦炎特異性抗血清中和 將三批豬乙型腦炎基礎(chǔ)種子凍干毒，每批取2瓶，分別用PBS液作1000倍稀釋，加入乙型腦炎特異性抗血清等量混合。置37℃水浴中和90 min。

1.4.3 參照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二○○○年版［2］“外源病毒檢驗(yàn)法”進(jìn)行熒光抗體法檢查外源病毒、綠猴腎傳代細(xì)胞檢查外源病毒和紅細(xì)胞吸附外源病毒試驗(yàn)。

1.4.4 用地鼠腎細(xì)胞檢測偽狂犬病病毒 將中和后的豬乙型腦炎凍干毒種與血清的混合物接種地鼠腎原代細(xì)胞4瓶，培養(yǎng)4 d傳2代，每代7 d，觀察細(xì)胞病變。同時(shí)用偽狂犬病病毒Bartha－K61株接種地鼠腎原代細(xì)胞，每瓶加入含1000TCID50病毒的維持液3 mL，共接種4瓶作為陽性對(duì)照組。

1.4.5 用小鼠檢測狂犬病病毒 取1.4.4項(xiàng)地鼠腎細(xì)胞傳2代培養(yǎng)物(偽狂犬病病毒檢驗(yàn)陰性)，每批腦內(nèi)注射5～7日齡乳鼠5只，每只0.03 mL。觀察7～10 d，乳鼠不發(fā)病，并于第7 d剖殺其中2只，取鼠腦組織制成10%懸液腦內(nèi)接種5～7日齡乳鼠5只，如此盲傳3代，最后一代觀察14 d，每代乳鼠健活為合格。

1.5 免疫原性檢測

1.5.1 小鼠免疫原性試驗(yàn) 將三批豬乙型腦炎基礎(chǔ)種子凍干毒，用PBS液作10倍系列稀釋，選取10－3～10－5三個(gè)稀釋度，分別皮下注射 10 ～12 g小鼠5只，0.1 mL/只，14 d后分別以乙腦強(qiáng)毒P3株腹腔攻擊，每只0.3 mL(含≥500個(gè)LD50)，同時(shí)每只小鼠腦內(nèi)接種稀釋液0.03 mL，觀察14日判定結(jié)果。對(duì)照小鼠死亡率應(yīng)≥80%，按Reed－Muench法計(jì)算半數(shù)保護(hù)劑量。

1.5.2 后備母豬的免疫原性試驗(yàn) 將豬乙型腦炎基礎(chǔ)種子F7代凍干毒稀釋至104～107TCID50免疫劑量，分別肌肉注射4頭健康敏感后備母豬。免疫4周后采血分離血清，分別采用反向血凝抑制試驗(yàn)和蝕斑減少中和試驗(yàn)測定抗體效價(jià)。后備母豬免疫4周后配種，配種40 d后，各肌肉注射乙腦強(qiáng)毒P3株105.8LD50(小鼠腹腔攻擊測定 LD50)。攻毒后72 h采血，接種原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)檢查病毒血癥。攻毒14 d后，每組剖殺兩頭，觀察胎兒成活情況，并取胎兒腦及脾制成10%懸液接種原代地鼠腎細(xì)胞分離病毒［3］。

1.6 毒力穩(wěn)定性檢測 將豬乙型腦炎原始種子(F4代)凍干毒在原代地鼠腎單層細(xì)胞培養(yǎng)傳代，連續(xù)傳代至 F12代。分別選取F5代、F8代、F10代、F12代病毒培養(yǎng)液進(jìn)行小鼠腦內(nèi)致病力試驗(yàn)，小鼠皮下感染入腦試驗(yàn)，乳鼠傳代返祖試驗(yàn)，測定該毒株在原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)傳代過程的毒力變化［4］。并選取上述相同代次病毒培養(yǎng)液經(jīng)仔豬皮下回傳1代、分離病毒測定其豬體傳代毒力變化。同時(shí)選取F5代、F8代、F10代、F12代病毒液進(jìn)行小鼠免疫原性試驗(yàn)，測定該毒株在原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)傳代過程的免疫原性變化［5］。

1.7 安全性檢測

1.7.1 參照《中華人民共和國獸藥典》二○一○年版三部［6］“豬乙型腦炎活疫苗”進(jìn)行小鼠腦內(nèi)致病力試驗(yàn)、皮下感染入腦試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)和乳豬安全性檢驗(yàn)。

1.7.2 大劑量接種初懷母豬的安全性試驗(yàn) 將三批豬乙型腦炎基礎(chǔ)種子凍干毒種，每批接種懷孕30日健康易感初孕母豬4頭，每頭肌肉注射2 mL(含10頭份)，觀察一個(gè)月。每日觀察體溫、精神、飲食情況，特別注意懷孕狀況。統(tǒng)計(jì)分娩情況，并對(duì)死亡仔豬取腦組織懸液，分別接種原代地鼠腎細(xì)胞，36～37℃培養(yǎng)7 d，觀察病變。

2 結(jié)果

2.1 外源病毒檢測結(jié)果

2.1.1 用牛睪丸細(xì)胞檢查外源病毒BVDV/MD，PK15細(xì)胞檢查外源病毒HCV和PPV，三價(jià)熒光抗體染色后，被檢細(xì)胞片無特異性熒光，表明三批基礎(chǔ)種子無BVDV/MD、HCV和PPV污染。將三批基礎(chǔ)種子分別與乙型腦炎特異性抗血清中和后，每批接種3瓶Vero細(xì)胞，連傳2代，每代7 d，用顯微鏡觀察細(xì)胞，均未出現(xiàn)細(xì)胞病變。同時(shí)作紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)，經(jīng)4℃和20～25℃兩種溫度吸附，鏡檢結(jié)果為陰性，表明三批基礎(chǔ)種子無能吸附紅細(xì)胞的外源病毒污染。

2.1.2 用地鼠腎細(xì)胞檢測偽狂犬病病毒，中和組細(xì)胞未出現(xiàn)病變，對(duì)照組細(xì)胞在接種后48 h出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，表明三批基礎(chǔ)種子無偽狂犬病病毒污染。

2.1.3 用小鼠檢測狂犬病病毒，乳鼠取腦盲傳三代后，小鼠未出現(xiàn)肌肉震顫、步樣失調(diào)和麻痹死亡等狂犬病癥狀，剩余小鼠全部健活，表明三批基礎(chǔ)種子無狂犬病病毒污染。

2.2 免疫原性檢測結(jié)果

2.2.1 小鼠免疫原性試驗(yàn) 三批基礎(chǔ)種子用小鼠測定半數(shù)保護(hù)劑量分別為103.23、103.27、103.20TCID50，表明三批基礎(chǔ)種子對(duì)小鼠免疫原性穩(wěn)定。

2.2.2 后備母豬的免疫原性試驗(yàn) 豬乙型腦炎基礎(chǔ)種子F7代凍干毒以105.0TCID50的免疫劑量即可使后備母豬全部抗體陽轉(zhuǎn)(表1)。

表1 不同劑量疫苗免疫豬抗體檢測試驗(yàn)

以105.0TCID50病毒劑量免疫后備母豬，4周后中和抗體達(dá)到1∶37，可使母豬獲得堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，攻毒后72 h病毒血癥檢驗(yàn)陰性，并保護(hù)胎兒不受病毒感染(表2)。

表2 后備母豬的免疫原性試驗(yàn)

2.3 毒力穩(wěn)定性檢測結(jié)果

2.3.1 選取F5代、F8代、F10代、F12代病毒培養(yǎng)液分別進(jìn)行小鼠腦內(nèi)致病力試驗(yàn)、皮下感染入腦試驗(yàn)和乳鼠傳代返祖試驗(yàn)，小白鼠全部健活。表明各代次病毒培養(yǎng)液小鼠腦內(nèi)致病力為零，皮下感染入腦致病力為零，毒力保持穩(wěn)定不變，無返祖現(xiàn)象［7］。

2.3.2 選取F5代、F8代、F10代、F12代病毒液分別接種4～8日齡健康易感仔豬，每頭皮下注射2.5 mL。接種72 h后剖殺，取血液和脾臟制成懸液接種原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)。將分離的病毒進(jìn)行小鼠腦內(nèi)致病力和皮下感染入腦試驗(yàn)測其致病力，結(jié)果各代次病毒液經(jīng)仔豬皮下傳1代，分離的病毒均與原毒株對(duì)小鼠致病力一致，毒力保持穩(wěn)定不變。

2.3.3 選取 SA14－14－2疫苗株 F5代、F8代、F10代、F12代病毒培養(yǎng)液，測定小鼠半數(shù)保護(hù)劑量，依次為 103.43、103.35、103.05、103.28TCID50，結(jié)果表明不同代次病毒免疫原性保持穩(wěn)定。

2.4 安全性檢測結(jié)果

2.4.1 三批豬乙型腦炎基礎(chǔ)種子分別進(jìn)行小鼠腦內(nèi)致病力試驗(yàn)、小鼠皮下感染入腦試驗(yàn)、小鼠毒性試驗(yàn)和乳豬安全性檢驗(yàn)，結(jié)果均合格。

2.4.2 將三批豬乙型腦炎基礎(chǔ)種子分別接種乙腦抗體陰性懷孕30 d初孕母豬，均未見疫苗接種引起的異常反應(yīng)，懷孕期間無一例流產(chǎn)，死亡仔豬病毒分離為陰性，結(jié)果表明豬乙型腦炎基礎(chǔ)種子大劑量接種初懷母豬安全(表3)。

表3 大劑量接種初懷母豬的安全性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與小結(jié)

豬乙型腦炎是由嗜神經(jīng)性很強(qiáng)的乙腦病毒引起的臨床上神經(jīng)癥狀嚴(yán)重的一種傳染病，因此研制活疫苗時(shí)首先要充分考慮疫苗株的安全性問題［3，8］。本文充分應(yīng)用 SPF 級(jí)小鼠、初孕母豬、乳豬這三種敏感動(dòng)物，通過小鼠腦內(nèi)致病力、皮下感染入腦、大劑量接種初孕母豬和乳豬等試驗(yàn)對(duì)三批基礎(chǔ)種子進(jìn)行安全性驗(yàn)證，結(jié)果表明三批基礎(chǔ)種子均對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無致病力，安全可靠。對(duì)SA14－14－2疫苗株F5代、F8代、F10代、F12代病毒培養(yǎng)液進(jìn)行乳鼠傳代返祖和仔豬皮下傳代返祖等毒力穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果表明疫苗毒株在傳代過程中毒力保持穩(wěn)定，無返強(qiáng)現(xiàn)象，神經(jīng)毒力回復(fù)的可能性相當(dāng)?shù)汀?/p>

基礎(chǔ)種子以105.0TCID50劑量免疫后備母豬可使母豬獲得堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，耐受強(qiáng)毒攻擊，對(duì)胎兒進(jìn)行乙腦病毒分離為陰性，充分證實(shí)母豬免疫后所產(chǎn)生的高水平特異性抗體阻止了胎盤感染。豬乙型腦炎病毒SA14－14－2疫苗株在原代地鼠腎細(xì)胞傳代至F12代，各代次病毒毒力和免疫原性保持穩(wěn)定，但通過原代地鼠腎細(xì)胞傳代次數(shù)過多會(huì)影響疫苗免疫原性［9－10］，因此，在保證將來疫苗生產(chǎn)需要的前提下，生產(chǎn)用種子的傳代應(yīng)控制在一定的范圍之內(nèi)，本研究將其限定在F10代以內(nèi)?？偠灾?，豬乙型腦炎SA14－14－2疫苗株基礎(chǔ)種子無外源病毒污染，具有可靠安全性和良好、穩(wěn)定的免疫原性，可用于疫苗生產(chǎn)。

［1］俞永新.流行性乙型腦炎減毒活疫苗的發(fā)展和應(yīng)用［J］.上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2006，18(03):110－112.

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