冷曉紅，李小萍，張 彤

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，銀川750021;2.寧夏泰瑞制藥股份有限公司，寧夏永寧750101)

磷酸替米考星可溶性粉為替米考星磷酸化后制成的可溶性粉制劑，為國家三類新獸藥，臨床試驗研究表明:治療雞支原體肺炎、慢性呼吸道疾?。?-2］和豬的支原體肺炎效果顯著，且具有較好的安全性［3-5］。磷酸替米考星可溶性粉制劑克服了替米考星不溶于水，生物利用度低，不方便臨床用藥等問題，是安全有效治療家畜呼吸系統(tǒng)疾病的新獸藥，但目前尚未有磷酸替米考星可溶性粉含量測定方法的報道，本試驗通過建立高效液相色譜法測定磷酸替米考星可溶性粉中磷酸替米考星含量的方法，為磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器，日本島津);WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)(日本島津)。

1.2 試劑與樣品 替米考星對照品，批號:K0310711，含量91.0%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;磷酸替米考星可溶性粉，批號:20100518、20100519、20100520，寧夏泰瑞制藥股份有限公司研制;乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其它均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 參考相關(guān)文獻［6-7］，選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以水-乙腈-磷酸二丁胺緩沖液〔取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液(1→10)70 mL，邊加邊攪拌，放置冷卻后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5±0.1，加水至100 mL〕-四氫呋喃(805∶115∶25∶55)為流動相;流速為每分鐘1.0 mL;檢測波長為280 nm，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗結(jié)果表明，替米考星的順式和反式異構(gòu)體峰峰面積之和的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%，，理論板數(shù)按替米考星順式峰計算不低于3000，替米考星的順式和反式異構(gòu)體峰之間的分離度應(yīng)符合要求。替米考星反式異構(gòu)體峰的相對保留時間為0.9，替米考星順式異構(gòu)體峰的相對保留時間為1.0(圖1-圖2)。

圖1 替米考星對照品HPLC色譜

圖2 磷酸替米考星可溶性粉HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取替米考星對照品25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈10 mL超聲溶解，用流動相稀釋至刻度，混勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取磷酸替米考星可溶性粉適量(相當(dāng)于替米考星25 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 測定法 按2.1項色譜條件，分別精密量取對照品和供試品各10 μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，外標(biāo)法以順式和反式異構(gòu)體峰面積之和計算磷酸替米考星含量。

2.3 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、空白溶劑及按工藝處方制備的不含主藥的陰性溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按照上述方法測定。結(jié)果陰性溶液及空白溶劑對試驗無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 取替米考星對照品250 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈10 mL超聲溶解，用流動相稀釋至刻度，混勻。取上述溶液0.1、0.2、0.6、1.0、1.5、2.0 mL 分別置于10 mL 量瓶中，用流動相稀釋至刻度。取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰至主峰保留時間的2倍。以順式和反式異構(gòu)體峰面積之和為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，計算線性，結(jié)果表明:替米考星在0.0516～1.032 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好?；貧w方程及為:

2.5 精密度試驗

2.5.1 重復(fù)性試驗 取同一批號磷酸替米考星可溶性粉供試品(批號20100518)6份，按照上述測定方法測定，結(jié)果替米考星順式和反式異構(gòu)體峰面積之和的RSD為0.4%，表明重復(fù)性良好。

2.5.2 中間精密度試驗 取同一批號供試品(批號20100518)6份，分別由A、B、C三人，在不同的時間，用不同儀器(Waters 515高效液相色譜儀、蘭博SSI LabAlliance高效液相色譜儀、日本島津LC-20AT高效液相色譜儀)，按照上述含量測定方法測定，結(jié)果精密度良好，RSD為0.27%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，自制備后，按含量測定方法，分別在 0、1、3、6、12 h 進樣測定。結(jié)果替米考星順式和反式異構(gòu)體峰面積之和的RSD為0.12%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗 取已知含量的磷酸替米考星可溶性粉，批號:20100518，含量以替米考星(C46H80N2O13)計 為 9.69% 約 100.0、130.0、150.0 mg各三份，精密稱定，分別置于50 mL量瓶中，分別加入替米考星對照品溶液(5.3040 mg/mL)2、2.5、3 mL各三份，用流動相稀釋至刻度，混勻。取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以順式和反式異構(gòu)體峰面積之和計算磷酸替米考星回收率，結(jié)果見表1，平均回收率為98.5%，RSD為2.0%。

表1 磷酸替米考星可溶性粉回收率試驗結(jié)果

上述方法學(xué)驗證的試驗結(jié)果表明，按照“2.1”項下的色譜條件進行磷酸替米考星可溶性粉的含量測定，方法可行。

2.8 樣品測定 取磷酸替米考星可溶性粉供試品3 批(批號:20100518、20100519、20100520)，按上述含量測定方法操作，測定其含量，三批產(chǎn)品的標(biāo)示含量分別為96.9%，92.6%和93.2%。

3 討論與小結(jié)

紫外吸收圖譜顯示:替米考星在280 nm～290 nm之間均有最大吸收波長，參考相關(guān)文獻［4-5］，選擇280 nm為測定波長。

在試驗中比較了水-乙腈-四氫呋喃-磷酸丁胺緩沖液(805∶110∶60∶25)［8］;將乙腈 105 mL、四氫呋喃53 mL、磷酸二丁胺緩沖液30 mL加入700 mL水中，用水稀釋到1000 mL［9］;乙腈-四氫呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸鹽緩沖液(130∶55∶25)［10］及水-乙腈-磷酸二丁胺緩沖液-四氫呋喃(805∶115∶25∶55)為不同流動相體系，結(jié)果確定了本方法的流動體系，磷酸替米考星中替米考星順式和反式異構(gòu)體峰之間及與其他成分可以得到較好的分離。

目前關(guān)于替米考星含量測定的文獻報道很多，但替米考星磷酸成鹽后，進一步制成可溶性粉制劑，用HPLC法測定磷酸替米考星可溶性粉中磷酸替米考星含量的方法未見報道。

本研究所建立的方法專屬性強、簡便、準(zhǔn)確，可用于磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量控制，同時為磷酸替米考星可溶性粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

［1］宗昕如，張曉輝，辛凌翔，等.磷酸替米考星可溶性粉對人工感染雞支原體的治療試驗.畜牧與獸醫(yī)［J］，2013，8:88-92.

［2］張繼瑜，李艷春.磷酸替米考星飲水劑治療雞敗血支原體的療效試驗，中國畜牧獸醫(yī)［J］，2004，31(12):39-40.

［3］張曉輝，宗昕茹，辛凌翔，等.磷酸替米考星對人工感染豬支原體肺炎的治療試驗.中國獸醫(yī)科學(xué)［J］，3013，43(5):515-521.

［4］中國獸藥雜志編輯部.磷酸替米考星.中國獸藥雜志［J］，2003，37(8):4.

［5］宗昕如，張曉輝，辛凌翔，等.磷酸替米考星可溶性粉在靶動物雞的安全性試驗.畜牧與獸醫(yī)［J］，2014，2:27-32.

［6］宋艷紅，孫 浩，等.HPLC法測定復(fù)方替米考星顆粒中有效成份含量.中國獸藥雜志［J］，2010，44(8):27-30.

［7］中國獸藥典委員會.中國獸藥典，二○一○年版一部.［S］.

［8］張旭東，呂瑞娥.高效液相色譜法測定飼料中替米考星含量.中國飼料［J］，2010，9:27-30

［9］閆春芝，趙紅彥，秦朝英.高效液相色譜法測定替米考星含量.中國獸藥雜志［J］，2006，40(8):26-27.

［10］張寶國.替米考星的高效液相分析，鄭州大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)［J］，2003:35(3):70-72