陳錫龍

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴陽550003)

《中華人民共和國獸藥典》中復方磺胺對甲氧嘧啶片［1］中磺胺對甲氧嘧啶(C11H12N4O3)的含量測定采用的是永停滴定法，但是在應(yīng)用實踐中，發(fā)現(xiàn)該方法穩(wěn)定性較差，主要原因可能是制劑中的輔料干擾了電極的敏感性，不能有效控制獸藥復方磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶的質(zhì)量。本研究建立了復方磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測定法，并根據(jù)“獸藥質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則”對新建立方法的準確度、重復性、精密度、專屬性、耐用性及線性等進行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥 Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀(配紫外檢測器);BP211D型電子分析天平(德國塞多利斯公司);超聲波清洗器(KQ-300DE，昆山市超聲儀器廠);磺胺對甲氧嘧啶鈉對照品(Dr.Ehernstorfer GmbH公司，批號:10228，含量:99.0%);試驗樣品復方磺胺對甲氧嘧啶片由某動物藥業(yè)有限公司提供(批號為:201121001、20121101、20121201);磺胺對甲氧嘧啶原料(某獸藥原料有限公司生產(chǎn)，批號:20130206);乙腈為色譜純;水為高純水;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Zorbax SB C18(5 μm，4.6×250 mm);柱溫為40℃;流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20);流速為1.0 mL/min;檢測波長為 270 nm［2］;進樣體積為 10 μL。在此色譜條件下，對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 磺胺對甲氧嘧啶色譜圖

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取磺胺對甲氧嘧啶鈉對照品約54 mg(含磺胺對甲氧嘧啶約50 mg)，置50 mL量瓶中，加鹽酸10 mL，超聲處理5～10 min。取出，加水稀釋至刻度，混勻，即得濃度為1.0 mg/mL的磺胺對甲氧嘧啶對照品貯備液。精密量取1.0 mg/mL的磺胺對甲氧嘧啶對照品貯備液5 mL，置于100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得50 μg/mL的磺胺對甲氧嘧啶對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取復方磺胺對甲氧嘧啶片20片，精密稱定，研細。精密稱取適量(約相當于磺胺對甲氧嘧啶0.2 g)置200 mL量瓶中，加鹽酸10 mL，超聲處理 5～10 min。取出，加水50 mL，再超聲處理5～10 min。取出，加水稀釋至刻度，過濾。精密量取5 mL濾液置于100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍 精密量取1.0 mg/mL的磺胺對甲氧嘧啶對照品貯備液 0.5、1、2、5、10 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，得含磺胺對甲氧嘧啶濃度分別為 5.0、10、20、50、100 μg/mL的對照溶液系列。精密吸取各對照溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖?；前穼籽踵奏舛仍?.0～100 μg/mL范圍內(nèi)，色譜峰有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Area＝33.56×Amt-12.15，相關(guān)系數(shù)大于0.999，標準曲線見圖2。

圖2 磺胺對甲氧嘧啶溶液的標準曲線

2.2 精密度 取企業(yè)提供的3批復方磺胺對甲氧嘧啶片樣品各20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于磺胺對甲氧嘧啶0.2 g);另精密稱取批號為20130206的磺胺對甲氧嘧啶原料藥粉約0.25 g。樣品和原料藥均按1.2.3項進行制備成供試品溶液，每個批號作三個平行，每個樣品進樣2針，進行含量測定，以Zorbax SB C18為固定相，采用50 μg/mL的標準溶液進行單點定量(除非特別說明，均以Zorbax SB C18為固定相，并用50 μg/mL的標準溶液進行單點定量計算，下同)。以測定結(jié)果百分含量的相對標準偏差表示試驗的精密度，精密度RSD分別為0.06、0.02、0.02和0.50，表明方法的精密度良好。結(jié)果見表1。

2.3 準確度 精密稱取2.2中研細的批號為20121001復方磺胺對甲氧嘧啶片粉末適量，按高(H)、中(M)、低(L)三個濃度水平分別添加磺胺對甲氧嘧啶原料藥粉(已知磺胺對甲氧嘧啶含量為89.50%)，制得向已知含量制劑中添加已知測定物的添加樣品，每個濃度水平的添加樣品分別制備3份供試樣。按1.2.3項制成供試品溶液，進行含量測定。以磺胺對甲氧嘧啶的實際測定含量和理論含量(制劑中磺胺對甲氧嘧啶的已有量+添加量)的比值計算磺胺對甲氧嘧啶的回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，三個不同添加水平的磺胺對甲氧嘧啶的回收率均在97.9% ～100.6%之間，方法具有良好的回收率。

表1 精密度及含量測量結(jié)果

表2 準確度測量結(jié)果

2.4 耐用性 取按準確度測定項下制得的樣品，保持流動相比例和流速不變，在Shimadzu LC2010及Agilent 1260 infinity色譜儀上分別使用Waters PHA C18(5 μm，4.6×250 mm)和 Zorbax SB C18(5 μm，4.6×250 mm)色譜柱，于40 ℃及15 ℃條件下進行測試，考察方法的耐用性，結(jié)果表明測量無顯著差異，說明耐用性良好。

2.5 專屬性 在樣品測試色譜圖中，標準出峰時間附近未發(fā)現(xiàn)明顯的干擾峰，可見方法的專屬性良好。

2.6 含量測定 方法同2.2精密度項，測量結(jié)果見表1。結(jié)果表明，批號為 20121001、20121101、20121201的三批企業(yè)樣品的磺胺對甲氧嘧啶平均含量分別為53.01%、52.03%和53.06%，磺胺對甲氧嘧啶原料藥粉中磺胺對甲氧嘧啶的平均含量為89.50%。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化。參考復方磺胺氯達嗪鈉粉的含量測定、磺胺類藥物殘留檢測方法及磺胺對甲氧嘧啶殘留的檢測方法可知，以前測量磺胺類藥物的高效液相色譜法所使用的流動相系統(tǒng)有0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18)［1］、乙腈-甲醇-水-乙酸(2+2+9+0.2)［3］、0.017 mol/L 磷酸 - 乙腈(80+20)［4］、磷酸鹽溶液 - 甲醇(65+35)［5］等。采用流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)時，磺胺對甲氧嘧啶的出峰時間適當，峰形良好，且0.1%的磷酸溶液也容易配制。

3.2 樣品提取方法的優(yōu)化。在進行樣品處理的過程中，分別采用10 mL鹽酸、稀鹽酸、0.4%的NaOH溶液溶解后，超聲處理5～10 min，然后再加水定容。發(fā)現(xiàn)采用10 mL鹽酸溶解后超聲處理5～10 min，然后加入50 mL水再超聲處理5～10 min，可以有效降低復方制劑中的輔料對磺胺對甲氧嘧啶的吸附，從而提高磺胺對甲氧嘧啶的回收率。

3.3 由于條件所限，在進行試驗時因無法得到復方磺胺對甲氧嘧啶片制劑的所有原料，故采用制劑添加磺胺對甲氧嘧啶原料藥粉的方法驗證準確度，同時，采用實測含量與理論含量進行比較的方法確定磺胺對甲氧嘧啶的回收率，這樣可以消除制劑中原有的磺胺對甲氧嘧啶對低水平添加回收率計算的影響。

3.4 高效液相色譜法還可以同時測定復方磺胺對甲氧嘧啶片中的甲氧芐啶，樣品色譜圖中保留時間約為4.2 min處的色譜峰即為甲氧芐啶，因篇幅所限，在此不再贅述。同時，樣品色譜圖中保留時間約為2.6 min處還有一個不明色譜峰，表明樣品中還含有其他不明物質(zhì)。

3.5 保持流動相比例和流速不變，在Shimadzu LC2010及Agilent 1260 infinity色譜儀上分別使用Waters PHA C18(5 μm ，4.6×250 mm)和 Zorbax SB C18(5 μm ，4.6×250 mm)色譜柱于40℃及15℃條件下對樣品進行測試，磺胺對甲氧嘧啶的保留時間有變化，但對測量結(jié)果無影響。

3.6 建立的復方磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶含量的高效液相色譜測定法是可行的，各項方法學指標均比較理想，可以作為復方磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶質(zhì)量控制標準。新方法采用高效液相色譜法測量復方磺胺對甲氧嘧啶片中磺胺對甲氧嘧啶含量的同時，還可以根據(jù)供試品溶液與對照品溶液主峰的保留時間是否一致對磺胺對甲氧嘧啶進行鑒別;現(xiàn)有方法采用永停滴定法測量磺胺對甲氧嘧啶的含量，雖然，永停滴定法使用的儀器設(shè)備比較簡單，容易操作，維護成本比液相色譜儀低。但需要作硫酸銅沉淀反應(yīng)鑒別其真?zhèn)?，操作程序稍顯繁瑣，同時，永停滴定法的專屬性也不如液相法佳。

［1］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典(二部)［M］.二○一○年版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社.

［2］查玉兵，陳 美，王曉芳，等。高效液相色譜法測定豬肉中五種磺胺類藥物殘留量［J］.分析儀器，2008，(4):44-45.

［3］中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸藥殘留檢驗操作規(guī)程CJCZ020［Z］.

［4］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)牧發(fā)［2001］38號文件［S］.

［5］耿士偉，曲 斌，姜加華，等.QuEChERS-UPLC-MS/MS快速測定雞肝中七種磺胺類藥物殘留［J］.中國獸藥雜志，2011，45(10):16-19.