譚鵬飛，南文龍，彭大新，毛開榮，陳義平*

(1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心診斷試劑研究室，山東青島266032;2.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009;3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為主要特征的人畜共患傳染病，嚴重威脅人和多種動物健康［1］。弱毒疫苗免疫是布病防控的重要手段，但其使用往往會干擾布病診斷和監(jiān)測。

布魯氏菌A19菌株于1923年由美國自牛奶中分離，經(jīng)實驗室自然傳代減毒后，成為一株毒力穩(wěn)定的弱毒菌株，是我國目前在用的布魯氏菌疫苗株之一［1］。疫苗株S19是在A19基礎(chǔ)上篩選出的赤蘚糖醇敏感株。S19基因組較A19存在Ery基因缺失，OIE將這一特點作為S19的鑒別診斷依據(jù)，但該方法并不適用于A19。目前，A19鑒別檢測研究尚少，本研究擬篩選、驗證A19基因組的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點，為疫苗株A19與野生菌株的鑒別提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 23種布魯氏菌見表1。布魯氏菌常見種及生物型標準株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存，布魯氏菌疫苗株 A19、S19、M5-90、S2、104M 由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心診斷試劑研究室保存。

表1 使用的布魯氏菌株及登錄號

1.1.2 主要試劑 dNTP、DL2000 Marker、EX Taq?Hot Start DNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司;蛋白酶K購自Sigma公司;胰蛋白胨培養(yǎng)基購自默克化工技術(shù)(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的培養(yǎng)及基因組DNA的提取 實驗菌株復蘇和培養(yǎng)參照中國獸醫(yī)菌種目錄中方法，細菌基因組DNA提取采用蛋白酶K法按常規(guī)步驟［2］進行。

1.2.2 SNP位點的分析篩選 從GenBank中下載與布魯氏菌疫苗株A19同源的S19株全基因組序列(GenBank登錄號:NC_010742.1、NC_010740.1)，利用生物信息學軟件BLAST和DNAstar，將S19基因組逐段與 GenBank中 B.melitensis M28、B.suis S1330、B.pinnipedialisB2/94、B.microti CCM 4915、B.canis ATCC 23365、B.ovis ATCC 25840 等16株布魯氏菌基因組序列進行比較，分析篩選S19全基因組序列SNP位點。

1.2.3 SNP位點的測序鑒定 以篩選出的SNP位點為依據(jù)，對含有SNP位點的相關(guān)基因設(shè)計引物(表2)，以A19基因組DNA為模板，進行PCR擴增，測序鑒定A19基因組SNP位點處的核苷酸序列。

反應體系 25 μL:10 ×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)2.0 μL、引物 (20 μmol/L)各 1.0 μL、EX Taq?Hot Start(5 U/μL)0.3 μL、Template 2.0 μL、ddH2O 9.7 μL;反應程序:95℃預變性5 min;95℃ 40 s，52～60℃(退火溫度根據(jù)引物Tm值確定)40 s，72℃40 s，35個循環(huán);72℃ 延伸6 min。PCR反應結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，PCR產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.2.4 SNP位點的選擇驗證 選擇2～3個經(jīng)鑒定正確的A19 SNP位點，以布魯氏菌常見種及生物型的標準株和疫苗株M5-90、S2、104M等共21株布魯氏菌的基因組DNA模板(表1，編號1-21)，按1.2.3方法，對相關(guān)基因進行擴增，PCR產(chǎn)物送寶生物工程(大連)有限公司測序。分析上述21株布魯氏菌基因組在所選SNP位點處的核苷酸序列，驗證所選SNP位點的A19特異性。

2 結(jié)果

2.1 SNP位點的分析篩選結(jié)果 將S19全基因組與GenBank中其他布魯氏菌全基因組序列進行比較，分析獲得29個SNP位點，堿基位置和變化見表3。

2.2 SNP位點測序鑒定結(jié)果 以A19基因組DNA為模板，對2.1中S19的29個SNP相關(guān)基因PCR擴增，均獲得了與預期相符的目的條帶(圖1)。測序結(jié)果顯示，A19這29個基因的序列與S19同源性為100%，說明A19基因組存在與S19基因組相同的29個SNP位點。

表2 SNP相關(guān)基因的PCR擴增引物

表3 S19基因組SNP位點所在基因堿基位置和變化

圖1 SNP相關(guān)基因PCR擴增結(jié)果

2.3 SNP位點的驗證結(jié)果 結(jié)果顯示，僅A19與S19 基因組存在 ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503的突變，而布魯氏菌常見種及生物型的標準株及疫苗株基因組相應位置均沒有變化，說明上述3個SNP位點為A19(或S19)特異。

3 討論

3.1 疫苗株A19的鑒別研究 布魯氏菌疫苗的鑒別主要包括血清抗體和病原兩方面。A19疫苗株為光滑型菌株，其LPS含有O-側(cè)鏈，能刺激機體產(chǎn)生抗體，對牛有一定的保護力，但也使常規(guī)血清學檢測方法無法區(qū)分疫苗免疫與自然感染［1］。在A19病原鑒別方面，谷文喜等［3］發(fā)現(xiàn)VirB8基因上108位堿基的G-T突變，可作為疫苗株A19和544A與野生菌株的鑒別依據(jù)之一;吳冬玲等［4］利用A19赤蘚醇代謝基因序列差異，區(qū)分了我國疫苗株A19和牛I型強毒株2308，但是上述兩種方法還未能明確區(qū)分出疫苗株A19與野生菌株。鐘旗等［5］建立了聚合酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析方法，首先以AMOS-PCR方法區(qū)分牛種布魯氏菌株，再以B1-PCR方法鑒定牛種生物I型菌株，然后以Ery-PCR方法對牛種生物I型菌株和A19株基因組DNA進行擴增，通過SSCP電泳根據(jù)條帶數(shù)目和大小的差異，區(qū)分了牛種生物I型菌株和A19株，從而對疫苗株A19與野生菌株進行了鑒別。目前，我國布病防控工作中，尚缺少直接、快速的疫苗株A19分子鑒別檢測方法。

3.2 疫苗株A19的SNP位點 SNP指單個核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子形態(tài)。近年，SNP位點廣泛的應用于細菌耐藥性基因、細菌分種分型、病毒分型等鑒別檢測中［6-8］。Gopaul等［9］利用S19基因組ClpX、LysR兩個基因SNP位點的差異，通過熒光定量PCR實現(xiàn)了S19的分子鑒別檢測。當前，我國尚未推廣弱毒疫苗S19株，A19與S19基因組具有高度的同源性，S19基因組特異的SNP位點，若在A19含有相同SNP位點，同樣適用于我國A19株的鑒別。

本研究以S19基因組為依據(jù)，經(jīng)與GenBank中公布的布魯氏菌全基因組比對，篩選了29個SNP位點，并證實A19基因組存在相同的SNP位點。選取ClpX G825-C825、LysR A605-C605、Omp2b G503-A503等3個SNP位點，通過與布魯氏菌常見種及生物型的標準參考株和疫苗株M5-90、S2、104M等共21株布魯氏菌的基因組SNP位點處的核苷酸序列比較，證明這3個SNP位點僅存在于A19(或S19)基因組上，而其他種、生物型布魯氏菌或疫苗株上均沒有發(fā)現(xiàn)相應突變，說明這3個SNP位點可用于我國布魯氏菌疫苗株A19與野生菌株的鑒別。同時，也說明Gopaul等［9］建立的S19鑒別檢測熒光定量PCR方法，目前同樣適用于我國布魯氏菌疫苗株A19的鑒別。

此外，筆者還對近年采集于我國布魯氏菌非免疫地區(qū)的血清及奶樣中提取的核酸樣品進行了檢測，其中經(jīng)B4/B5-PCR方法［10］檢測陽性的樣品，經(jīng)本方法檢測均未發(fā)現(xiàn)上述3個基因SNP位點處存在突變，即樣品為非疫苗株A19的野生菌株感染。

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