白 楊，許應天，吳艷麗，于志云

(1.吉林正業(yè)生物制品股份有限公司，吉林吉林132101;2.延邊大學，吉林延吉133002)

牛瑟氏泰勒蟲病是由瑟氏泰勒蟲寄生于牛的紅細胞和單核巨噬系統(tǒng)細胞內(nèi)引起的一種蜱傳播性血液原蟲?。?］。該病在本地牛多數(shù)呈帶蟲，染蟲率較低，外地引進牛和改良牛染蟲率較高，死亡率也很高［2］。牛瑟氏泰勒蟲p23主要表面蛋白是紅細胞感染階段的一種蟲體表面蛋白，當用孢子持續(xù)感染牛時，雖然瑟氏泰勒蟲表面抗原不斷發(fā)生變化，卻始終都能檢測到 p23表面蛋白的表達［3］。p23因具有較好的免疫原性［4］，故是診斷和預防該病的理想抗原之一［5］。

白細胞介素18(interleukin，IL-18)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要的細胞免疫調(diào)節(jié)因子，具有多種生物學功能，其應用研究十分活躍［6-9］。IL-18屬于IL-1家族成員，是機體先天性和獲得性免疫的重要調(diào)節(jié)因子。IL-18在慢性炎癥、自體免疫性疾病、各種各樣的癌變及眾多傳染病的發(fā)生過程中都有表達，所以IL-18自發(fā)現(xiàn)以來就一直受到各國研究人員的關注。1999年，IL-18基因的克隆和IL-18活性分析由 Shoda［10］完成。2002 年 Nagata T 等［11］將該基因在家蠶中表達，實驗是通過桿狀病毒系統(tǒng)完成。目前，研究較多的也是其在參與機體免疫方面的功能，在提高牛的抗感染力、增強滅活苗或基因工程苗免疫作用方面具有廣闊的應用前景。本研究以pMD18-T-p23-IL-18質(zhì)粒為材料，構建牛瑟氏泰勒蟲原核表達質(zhì)粒pET-28a-p23-IL-18，并進行表達，以期為牛瑟氏泰勒蟲病基因工程亞單位疫苗的制備提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和載體 質(zhì)粒pVAXI-p23、pMD18-IL-18、DH5α菌種、pET-28a載體菌液均由延邊大學預防獸醫(yī)實驗室保存。

1.2 主要試劑 DNA Ligation Kit Ver.2.1，pMD18-T-Simple 載體，T4 DNA Lingase，BamH I，EcoR I，ExTaq酶，質(zhì)粒小量抽提試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA Maker，F(xiàn)ITC標記的羊抗牛IgG，RNase和巰基乙醇，均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank中報道的牛瑟氏泰勒蟲p23序列(D84447)及牛白細胞介素18cDNA序列(BC102879)設計了兩對特異性的引物。其中含有長度為45 bp的linker序列為中間接頭(Gly4Ser)3核苷酸，由p2和p3共同編碼，即方框的部分。p2引物與p3引物的5’端有24 bp的堿基互補，為陰影部分。在p1與p4引物上含有酶切位點，設計的引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。p1和p2用于擴增IL-18基因序列，預測擴增長度為526 bp，重組后目的片段長度約為1048 bp。

p3和p4用于擴增p23基因序列，預測擴增長度為522 bp。p3:

1.4 重組基因的構建 參考文獻劉娟等的試驗方法［12］以現(xiàn)有質(zhì)粒pMD18-IL-18為模板，以p1和p2為引物，擴增IL-18基因片段;以pVAXI-p23為模板，以p3和p4為引物，擴增p23基因片段。將以上2次PCR產(chǎn)物混合作為PCR反應模板，以pl和p4為引物，進行PCR擴增，重組基因p23-IL-18。

1.5 克隆載體pMD18-T-p23-IL-18的構建及鑒定 將純化后的p23-IL-18與pMD18-TSimple Vector進行連接。連接體系:PCR回收產(chǎn)物4 μL，pMD18-T-Simple Vector 1 μL，Vector Buffer 5 μL，4℃鏈接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌。挑取經(jīng)Amp抗性篩選的菌落后培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切鑒定正確后命名為pMD18-T-p23-IL-18。

1.6 原核表達載體pET-p23-IL-18的構建及鑒定 將pMD18-T-p23-IL-18與pET-28a載體分別用BamH I和EcoR I進行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA連接酶連接。連接體系為:T4 DNA Lingase 1 μL，T4 DNA ligation buffer 2.5 μL，p23-IL-18 10 μL，pET-28a 2 μL，16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌，小量提取質(zhì)粒。經(jīng) PCR(引物為 p1和 p4)、酶切(BamH I和EcoR I)、測序鑒定正確后的重組質(zhì)粒命名為pET-p23-IL-18。

1.7 重組表達質(zhì)粒的誘導表達 將鑒定為陽性的重組表達菌50 μL接種于5 mL LB培養(yǎng)液(含Amp 100 μg/mL)中，37℃過夜培養(yǎng)后，按1%接種于新鮮 LB培養(yǎng)液中，振搖至OD600nm為0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導表達。分別在0、2、4、6和8 h各收集2 mL菌液，同時收集未誘導的菌液作為陰性對照。SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色觀察，并作Western-blotting分析。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增 取5 μL的PCR產(chǎn)物使用21.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。p23與IL-18基因擴增結果顯示均在500 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與預期大小相符合(圖1);重組后基因擴增結果顯示在1000 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與預期大小相符合(圖2)。

圖1 p23與IL-18基因的PCR擴增

圖2 p23-IL-18融合基因的PCR擴增

2.2 陽性克隆載體的鑒定 重組克隆質(zhì)粒用特異性引物p1，p4擴增出1000 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，然后用 EcoRⅠ和 BamHⅠ酶切出長度為1000 bp左右的片段(圖3)，說明目的片段已成功擴增并正確插入到克隆載體pMD-18-T Simple中。測序結果表明，克隆得到的重組基因p23-IL-18基因片段大小為1048 bp。此基因片段與GenBank中已發(fā)表的牛瑟氏泰勒蟲p23核苷酸序列、牛IL-18核苷酸序列同源性為99%。

2.3 重組表達質(zhì)粒pET-28a-p23-IL-18的鑒定 用BamHⅠ和EcoRⅠ對初步篩選為陽性的重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。結果顯示，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，得到了約3000 bp和1048 bp的兩條片段(圖4)，說明目的基因片段已正確地克隆到pET-28a原核表達載體中。

圖3 重組質(zhì)粒pMD18-T-p23-IL-18的PCR及酶切鑒定結果

圖4 重組質(zhì)粒pET-28a-p23-IL-18的PCR及酶切鑒定圖

2.4 目的基因的誘導表達 誘導的pET-28ap23-IL-18陽性菌在約48 kDa處出現(xiàn)明顯特異性條帶(圖5)，與預期結果相符，重組表達菌在6 h時表達量最高。

2.5 表達產(chǎn)物的Western-blotting檢測 表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進行Western-blotting檢測，在PVDF膜上出現(xiàn)特異性條帶，表達產(chǎn)物能被牛瑟氏泰勒蟲陽性血清所識別，證明目的基因的表達產(chǎn)物具有較好的反應原性(圖6)。

圖5 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳

圖6 表達產(chǎn)物的Western-blotting分析

3 討論

細胞因子通過復雜網(wǎng)絡調(diào)節(jié)機體免疫，細胞因子失衡或調(diào)節(jié)異常都與疾病有著密切的關系。IL-18是一種很強的IFN-γ誘導劑，其生物學活性是通過調(diào)節(jié)IFN-γ的表達來提高機體細胞免疫水平。因此BolIL-18可望成為疫苗的一種重要的細胞免疫佐劑［13-15］，在提高牛的抗感染力、增強滅活苗或基因工程苗免疫作用方面具有廣闊的應用前景。本實驗利用現(xiàn)有質(zhì)粒為模板，將牛白細胞介素18與牛瑟氏泰勒蟲的p23表面蛋白基因通過重疊延伸拼接聚合酶鏈式反應(SOE-PCR)將兩段基因串連在一起，并連接到原核表達載體上，構建原核表達重組質(zhì)粒。Western-blotting結果證實表達產(chǎn)物能被牛瑟氏泰勒蟲陽性血清所識別，證明表達產(chǎn)物具有較好的反應原性。

牛瑟氏泰勒蟲p23基因全長672 bp，具有完整的開放閱讀框，編碼223個氨基酸，N末端有28個氨基酸殘基的信號肽序列，疏水區(qū)多纈氨酸，C末端是跨膜區(qū)域，69～71位有一個潛在的N糖基化位點，為ASn-Ile-Ser，p23是單拷貝基因，并有等位基因?；瘜W組成分析酪氨酸含量較多，彌補了p23作為抗原蛋白分子量較小的不足，且親水性較強，膜表面抗原決定簇豐富，具有疫苗候選分子的基礎。

在進行原核細胞表達時，多以融合蛋白為表達形式作為載體，這樣既可防止宿主菌的蛋白醇對所表達目的蛋白的降解，也有利于表達蛋白的純化，最終保護目的蛋白的活性。故本試驗選用pET-28a為載體，可將外源蛋白表達在細胞質(zhì)內(nèi)，在N端和C端都能加His-tag，pET-28a沒有本身溶解性髙的多肽融合蛋白，也沒有催化二硫鍵形成的酶融合蛋白，而且不含信號肽序列，這為純化目的蛋白提供了有利條件。同時pET-28a上的大部分酶切位點都不會造成閱讀框移位。

基于上述研究，本實驗將IL-18基因和p23基因融合在一起，成功構建了雙基因融合的基因工程菌株，并探討p23和IL-18雙基因融合產(chǎn)物作為亞單位疫苗成分的可行性［16］，為探索牛瑟氏泰勒蟲雙基因工程疫苗奠定了理論依據(jù)。

［1］蔣金書.動物原蟲病學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2001.

［2］Schnittger Leonhard，Katzer Frank，Biermann Reinhild，et al.Characterization of a polymorphic Theileria annulata surface protein(TaSP)closely related to PIM of Theileria parva:implications for use in diagnostic tests and subunit vaccines［J］.Molecularandbiochemicalparasitology， 2002， 120(2):247-256.

［3］Wen Zhong Zhuang，Chihiro Sugimoto，Shuichi Kubota，et al.Antigenic alteration in major piroplasm surface proteins of Theileria sergenti during infection［J］.Veterinary Parasitology，1995，60(3/4):191-198.

［4］金春梅，許應天，張守發(fā)，等.牛瑟氏泰勒蟲P33主要表面蛋白基因的克隆與序列分析［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2007，(2):112-114.

［5］Zhang W，Sugimoto C，Matsuba T，et al.Analysis of antigentic and genetic of Theileria sergenti major piroplasm surface proteins［J］.Net Med Sci，1994，56:469-473.

［6］Bokarewa M，Hultgren O.Is interleukin-18 useful for monitoring rheumatoid arthritis?［J］.Scandinavian journal of rheumatology，2005，34(6):433-436.

［7］Yano Ai，Nakao Kazushi，Sarai Ai，et al.Elevated serum interleukin-18 levels might reflect the high risk of hospitalization in patients on peritoneal dialysis［J］.Nephrology(Carlton ，Vic.)，2005，10(6):576-582.

［8］Thong-Ngam D，Tangkijvanich P，Lerknimitr R，et al.Diagnostic role of serum interleukin.1 8 in gastric cancer patients［J］.World J Gastroenterol，2006，12(28):4473-4477.

［9］Shinoda Masahiro，Wakabayashi Go，Shimazu Motohide，et al.Increased serum and hepatic tissue levels of interleukin-18 in patients with fulminant hepatic failure［J］.Journal of gastroenterology and hepatology，2006，21(11):1731-1736.

［10］Shoda L K，Zarlenda D S，Hirano A.Cloning of a cDNA encoding bovine interleukin-18 and analysis of IL-18 expression in macrophages and its IFN-gamma-inducing activity［J］.J Interferon Cytokine Res，1999，(10):1169-1177.

［11］Nagata T，Ishikawa S，Shimokawa E，et al.High level expression and purification of bioactive bovine interleukin-18 using a baculovirus system［J］.Vet Immunity，2002，87(8):65-72.

［12］劉 娟，劉明遠，于 錄，等.RV-G/LTB雙基因融合真核質(zhì)粒表達載體的構建并在vero細胞中的表達［J］.中國生物制品學雜志，2011，24(3):255-258.

［13］邢秀娟.牛IL-18真核表達載體的構建及其對FMD疫苗免疫增強作用的研究［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學，2008.

［14］葉麗萍，王春鳳.細胞因子免疫佐劑效應機制及其在獸醫(yī)臨床中的應用［J］.中國畜牧獸醫(yī)2012，(11):196-199.

［15］劉建文，李月輝，王健春.基因疫苗及其免疫佐劑研究進展［J］.中國獸醫(yī)雜志，2007，(3):41-43.

［16］孫平杰.牛瑟氏泰勒蟲p23表面蛋白基因與牛白細胞介素18基因在原核和真核細胞中的串聯(lián)表達［D］.延邊:延邊大學，2012.