王 彬，藏玉婷，宋 揚(yáng)，柴 華，丁國(guó)杰

(哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心，哈爾濱150069)

卵黃抗體是禽類對(duì)特定抗原在卵黃中所產(chǎn)生的相應(yīng)特異性抗體［1］。卵黃抗體是一種天然存在、無(wú)殘留、無(wú)毒副作用的免疫球蛋白，是抗生素的替代品［2］。目前高免卵黃液廣泛應(yīng)用于一些疾病的緊急預(yù)防和治療。

在制備黃抗體時(shí)，盡管免疫雞為經(jīng)過(guò)挑選、檢查和進(jìn)行了某些疫病的預(yù)防接種的健康產(chǎn)蛋母雞，但仍存在一些蛋媒性的病毒混入卵黃抗體中的可能，從而影響抗體的安全性。目前，國(guó)內(nèi)卵黃抗體生產(chǎn)普遍采用甲醛滅活的方法，其他滅活劑的滅活效果還未見報(bào)道。為此，本研究選用甲醛和二乙烯亞胺(BEI)作滅活劑，檢測(cè)對(duì)卵黃抗體中人工加入病毒的滅活效果，從中選擇適合的濃度、滅活時(shí)間和滅活溫度等，以期建立對(duì)卵黃抗體中外源病毒的有效滅活方法。

1 材料

1.1 卵黃抗體 采用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的酸化水-辛酸-硫酸銨三步法制備的小鵝瘟精制卵黃抗體，瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶64。經(jīng)檢測(cè)不含禽腦脊髓炎和傳染性法氏囊病毒抗體。

1.2 指示病毒 禽流感病毒(AIV):H9亞型，自行分離鑒定，EID50≥10-6.5/0.1 mL，血凝價(jià)為1∶512;雞新城疫病毒(NDV):Ⅰ系中等毒力株，EID50≥10-7.25/0.1 mL，血凝價(jià)為1∶160;禽傳染性法氏囊病病毒(IBDV):B87株，ELD50為10-6.5/0.2 mL;減蛋綜合征病毒(EDSV):EID50為10-6.8/0.1 mL，血凝價(jià)≥1:1024，均由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心保存;禽腦脊髓炎病毒(AEV):Van Roekel株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，EID50為10-6.2/0.2 mL。

1.3 滅活劑 甲醛溶液，分析純，產(chǎn)地天津;BEI，瑞士進(jìn)口。

1.4 SPF種蛋 6和11日齡SPF雞蛋購(gòu)自斯帕法斯SPF雞場(chǎng);10日齡SPF鴨蛋購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方法

2.1 指示病毒的滅活 將AEV和小鵝瘟卵黃抗體以1∶9的比例混合;NDV、AIV和EDSV分別與普通肉湯培養(yǎng)基按1∶9的比例混合;IBDV和卵黃抗體按1∶9的比例混合。將上述的混合液各加入3種不同濃度(0.03%、0.05%和0.08%)的甲醛溶液和BEI，置室溫(25℃)滅活24 h，同時(shí)設(shè)未經(jīng)滅活的卵黃抗體混合液作對(duì)照。

2.2 卵黃抗體的滅活 將卵黃抗體分別加入3種不同濃度(0.03%、0.05%和0.08%)的甲醛溶液和BEI，置室溫(25℃)滅活24 h。

2.3 滅活效果檢查 雞胚接種:取滅活后的AEV混合液經(jīng)卵黃囊接種6日齡雞胚，每胚0.2 mL，觀察至10 d;NDV、AIV混合液分別經(jīng)尿囊腔接種11日齡雞胚，每胚0.2 mL;IBDV混合液經(jīng)尿囊膜接種11日齡雞胚，每胚0.2 mL，觀察7 d，并記錄雞胚的死亡情況和病理變化。同時(shí)設(shè)置病毒陽(yáng)性對(duì)照。

鴨胚接種:取滅活后的EDSV混合液經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚，觀察7 d，并記錄鴨胚的死亡情況和病理變化，同時(shí)設(shè)置病毒陽(yáng)性對(duì)照。

血凝活性檢查:用不同方法滅活的病毒混合液接種雞胚(或鴨胚)后，在觀察胚體死亡情況的同時(shí)，收獲胚液做紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。

2.4 滅活后卵黃抗體的檢測(cè) 卵黃抗體效價(jià)測(cè)定:以瓊擴(kuò)方法［3］測(cè)定抗體效價(jià)。蛋白含量測(cè)定:以考馬斯亮藍(lán)染色法［4］測(cè)定抗體中的蛋白量。純度測(cè)定:以SDS-PAGE檢查［5］，分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，電壓120 V，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

3 結(jié)果

3.1 滅活效果檢查 5種混有指示病毒的卵黃抗體經(jīng)甲醛和BEI處理后，經(jīng)不同途徑接種雞胚(或鴨胚)，孵育觀察后，發(fā)現(xiàn)0.02%BEI和0.03% 甲醛均不能將指示病毒全部滅活，而0.05% 和0.08%甲醛溶液則均能將指示病毒滅活。結(jié)果見表1。

3.2 血凝價(jià)測(cè)定結(jié)果 表2結(jié)果表明，0.02%BEI滅活的混合液接種的雞胚(鴨胚)的尿囊液仍有部分血凝性，而甲醛滅活的病毒混合液則沒(méi)有血凝性。

表1 不同方法滅活后接種雞胚(或鴨胚)的存活情況

表2 不同方法滅活后血凝價(jià)測(cè)定結(jié)果

3.3 雞胚的病理變化 AEV接種后10和11日齡陽(yáng)性對(duì)照組各死亡1只雞胚，其余均存活。解剖雞胚，檢查胚胎的病理變化，觀察到陽(yáng)性對(duì)照組雞胚矮小萎縮、腳趾蜷曲、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良等典型的禽腦脊髓炎病理變化，而陰性對(duì)照組的雞胚均發(fā)育正常。

3.4 滅活后的卵黃抗體檢測(cè) 分別用終濃度為0.02%的BEI，0.03%、0.05%和0.08%甲醛滅活的卵黃抗體作瓊擴(kuò)效價(jià)測(cè)定、蛋白含量測(cè)定和SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，以上4種方法滅活前后抗體效價(jià)均為1∶64，未發(fā)生變化;滅活前后蛋白含量未發(fā)生變化，即以上處理未造成蛋白變性沉淀;滅活后的樣品均未出現(xiàn)雜帶(圖1)，顯示該處理未造成蛋白降解。

圖1 SDS-PAGE電泳圖

4 討論

要保證卵黃抗體制品的安全性，除了對(duì)產(chǎn)蛋母雞嚴(yán)格選擇，并對(duì)蛋媒性傳染病進(jìn)行檢驗(yàn)外，在免疫球蛋白提取、純化的過(guò)程中進(jìn)行外源病毒滅活處理，是十分重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。目前普遍采用的化學(xué)滅活劑為β-丙內(nèi)酯、鹽酸聚六亞甲基胍、BEI和甲醛。徐守振等［6］比較了四種不同滅活劑對(duì)新城疫病毒的滅活效果，效果最好的為β-丙內(nèi)酯，其次為鹽酸聚六亞甲基胍和甲醛，滅活效果最差的為BEI。β-丙內(nèi)酯雖然滅活效果好，但價(jià)格較高，而甲醛作為普遍使用的滅活劑造價(jià)較低，適合廣泛應(yīng)用。

本研究在提取卵黃抗體的工藝流程中，首先使用辛酸處理，有效地滅活了部分病毒［7］，同時(shí)為了提高產(chǎn)品的安全性，在提取時(shí)還增加了其他滅活步驟。為更好的推廣卵黃抗體制品，本研究主要測(cè)試甲醛及BEI二種滅活劑的滅活效果和合理使用濃度。

BEI是一種毒性弱且可自行分解的烷化劑。這類化合物的化學(xué)性質(zhì)活潑，滅活機(jī)制是烷化核酸分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙螺旋鍵交聯(lián)，妨礙RNA的合成，從而抑制細(xì)胞分裂。另外，它也可與微生物的酶系統(tǒng)和核酸蛋白起作用，干擾核酸代謝。因此，這類滅活劑能破壞病毒核酸，使其完全喪失感染力，但并不損害病毒表面蛋白，從而保留其抗原性［8］。

甲醛作為滅活劑，主要使微生物的蛋白質(zhì)、核酸變性，導(dǎo)致死亡，但不明顯影響其免疫原性，但過(guò)量的甲醛會(huì)殘留在制品中對(duì)卵黃抗體蛋白和動(dòng)物機(jī)體造成損害。根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》相關(guān)規(guī)定［9］，制品中甲醛含量不應(yīng)超過(guò)0.2%。為使卵黃抗體中甲醛殘留量不超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)能夠滿足滅活外源病毒的情況，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的甲醛終含量對(duì)人工混入卵黃抗體中的外源病毒進(jìn)行滅活試驗(yàn)。本研究采用0.02%的BEI與0.05%的甲醛作為外源病毒的滅活劑進(jìn)行研究比對(duì)，BEI不能完全滅活，甲醛滅活效果較為明顯。

本研究對(duì)5種常見指示病毒滅活效果進(jìn)行了檢查，旨在對(duì)目前卵黃抗體滅活方法提供理論依據(jù)，對(duì)其他有關(guān)病毒的滅活效果有待進(jìn)一步檢測(cè)。

［1］孫智鋒.母雞──未來(lái)的抗體制造廠［J］.國(guó)外畜牧學(xué)豬與禽，1994，(3):67-69.

［2］高云英，趙發(fā)苗，張金良，等.雞抗豬大腸桿菌高免卵黃抗體的研制與應(yīng)用［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2003，1:6-7.

［3］中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社第一編輯室.動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)匯編［M］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004:473-478.

［4］宋宏新，李敏感.現(xiàn)代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程［M］.陜西人民出版社，2002.

［5］楊安綱，毛積芳，藥立波.生物化學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2001:248.

［6］徐守振，王 新，伊燕博.四種不同滅活劑對(duì)新城疫病毒的滅活效果研究［J］.中國(guó)家禽，2011，33(14)15-19.

［7］譚亞軍，張庶民.抗血清制品的病毒去除/滅活［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2009，22(10):1046-1048.

［8］趙本進(jìn)，潘饒茴，陳曉清，等.二乙烯亞胺(BEI)滅活豬細(xì)小病毒的試驗(yàn)報(bào)告［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2004，6:19.

［9］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程二OOO年版［S］.18.