岑運(yùn)光，陳相健

(1.海南省人民醫(yī)院 醫(yī)療保健中心，海南 海口 570311;2.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，江蘇 南京 210029)

心房纖顫(atrial fibrillation，AF)是臨床常見的持續(xù)性心律失常，隨著年齡的增長其發(fā)病率逐漸增加［1］。心房電生理性重構(gòu)目前被認(rèn)為與增齡性房顫密切相關(guān)，其主要涉及到心房有效不應(yīng)期縮短或頻率適應(yīng)性降低，心房肌結(jié)構(gòu)適應(yīng)性及非適應(yīng)性改變等［2-3］。在介導(dǎo)房顫短期或長期的電重構(gòu)及房顫發(fā)生的病理生理機(jī)制中，鈣超載為首要因素，而鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)的過表達(dá)是近年來被廣泛關(guān)注的心房電重構(gòu)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［4-5］。本研究旨在通過觀察鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN93對心房肌細(xì)胞中鈣超載及CaMKII蛋白的影響，為房顫防治提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 伊屋諾霉素(ionomycin)、KN93、FLUO-3/AM(S1056)鈣離子熒光探針、Pluronic-F127凝膠均產(chǎn)自美國Sigma公司;D-hanks液產(chǎn)自美國Hyclone公司;新生牛血清產(chǎn)自德國PAA公司;DMEM培養(yǎng)基、考馬斯亮藍(lán)G250購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司;CaMKII抗體產(chǎn)自英國Abcam公司;FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自武漢博士德公司。主要儀器有激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSCM 510 META，德國)，蛋白核酸分析儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用差速貼壁分離技術(shù)分離純化培養(yǎng)心房肌細(xì)胞96 h，篩選搏動(dòng)性嫩良好的細(xì)胞隨機(jī)分為5組，每組細(xì)胞數(shù)100，對照組和鈣超載組細(xì)胞置入無血清培養(yǎng)基，KN93藥物處理組細(xì)胞分別置入KN93終濃度為0.25、0.5、1.0μmo/L劑量的無血清培養(yǎng)基中。除對照組外，其它各組給予Fluo-3/AM(終濃度為4μmol/L)熒光指示劑負(fù)載，并加入鈣離子導(dǎo)入劑ionomycin 1.0μmo/L孵育0.5 h。

1.3 Fluo-3/AM鈣離子熒光負(fù)載 細(xì)胞給藥24 h后，棄去原培養(yǎng)液，適量Pluronic-F127(終濃度為1 ul/mL)和Fluo-3/AM(終濃度為4μmol/L)加于負(fù)載心房肌細(xì)胞的蓋玻片上，37℃，5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育45 min。負(fù)載后的細(xì)胞以D-hanks液清洗3次，DMEM孵育0.5h(對照組)。

1.4 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+激光共聚焦顯微鏡測定用Fluo-3/AM負(fù)載的細(xì)胞，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm激光下光切掃描(物鏡×40)，掃描密度512×512，每張樣本取15～20個(gè)視野，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)化分析。每組檢測100個(gè)細(xì)胞，3個(gè)視野動(dòng)態(tài)監(jiān)測15 min。

1.5 Western blot測定細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ的表達(dá) 分離純化后的心房肌細(xì)胞按每3×106個(gè)細(xì)胞加入2 uL PMSF和0.2mL RIPA，提取CaMKII蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳、硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印后、Tween 37℃封閉，加入CaMKII抗體(1∶1000)，37℃反應(yīng)過夜，經(jīng)辣根酶標(biāo)記的羊lgG(1∶2000)反應(yīng)2 h(37℃)，DAB顯色，用Quantity one凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，結(jié)果以積分光密度值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 評價(jià)指標(biāo) 細(xì)胞內(nèi)游離［Ca2+］i:以記錄時(shí)間內(nèi)(80 s)的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度;收縮頻率:記錄時(shí)間內(nèi)(80 s)的心肌細(xì)胞自發(fā)收縮次數(shù);平均鈣瞬變幅度:表示在心肌細(xì)胞收縮時(shí)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的相對變化幅度;平均鈣瞬變幅度=(峰值熒光強(qiáng)度-波谷熒光強(qiáng)度)/(收縮次數(shù)×對照組熒光強(qiáng)度);抑制率%=(鈣超載組熒光值－KN93干預(yù)鈣超載組熒光值)/鈣超載組熒光值×100%

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)計(jì)量資料采用“±s”表示，采用單因素方差分析比較組間差異，采用LSD-t法進(jìn)行兩兩檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KN93對心房肌細(xì)胞內(nèi)游離［Ca2+］i和鈣瞬變的影響

通過實(shí)驗(yàn)方案，觀察KN93對心肌細(xì)胞內(nèi)游離［Ca2+］i的糾正作用。結(jié)果顯示，ionomycin誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)的游離［Ca2+］i較對照組明顯增強(qiáng)，提示心肌細(xì)胞鈣超載模型構(gòu)建成功;給予KN93后，心房肌細(xì)胞內(nèi)游離［Ca2+］i受到明顯抑制(見圖1)。0.25μmol/L，0.5μmol/L，1.0μmol/L不同濃度的KN93對細(xì)胞內(nèi)游離［Ca2+］i的抑制率分別為10.02%，22.55%，27.78%，提示KN93可抑制ionomycin誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鈣超載。

圖1 不同組間心房肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光像素值1.對照組;2.鈣超載組3.KN93組(0.25μmol/L);4.KN93組(0.5μmol/L);5.KN93組(1.0μmol/L);*P＜0.05，與對照組相比;ΔP＜0.05，與鈣超載相比Fig.1 Free Ca2+fluorescence pixels in atrial muscle cells within different groups1.Control group;2.calcium overload group;3.KN93group(0.25μmol/L);4.KN93group(0.5μmol/L);5.KN93group(1.0μmol/L)*P＜0.05，compared with control group;ΔP＜0.05，compared with calcium overload group

2.2 KN93對心房肌細(xì)胞鈣瞬變和自發(fā)性收縮頻率的影響

鈣超載組心肌細(xì)胞鈣瞬變較對照組明顯增強(qiáng)，給予KN93后，心房肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變受到抑制，且不同濃度的KN93對細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的抑制呈劑量反應(yīng)關(guān)系(見圖2)。但KN93對心肌細(xì)胞的自發(fā)性收縮頻率影響的比較中，差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

圖2 不同組間心房肌細(xì)胞內(nèi)平均鈣瞬變值(a)和心房肌細(xì)胞自發(fā)性收縮頻率(b)1.對照組;2.鈣超載組;3.KN93組(0.25μmol/L);4.KN93組(0.5μmol/L);5.KN93組(1.0μmol/L);Fig.2 Average calcium transient value in atrial muscle cells within different groups1.Control group;2.calcium overload group;3.KN93 group(0.25μmol/L);4.KN93 group(0.5μmol/L);5.KN93 group(1.0μmol/L)

2.3 KN93對CaMKⅡ表達(dá)水平的影響 為了消除誤差帶來的影響，以β-actin蛋白濃度為內(nèi)參，用Western blot檢測不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞CaMKⅡ的表達(dá)水平(見圖3)，不同實(shí)驗(yàn)組所測蛋白濃度與β-actin的蛋白濃度的比值為該組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)值，結(jié)果顯示:對照組、鈣超載組，KN93(0.25、0.5、1.0 μmol/L)組CaMKⅡ/β-actin 分別為:0.52，1.49、0.41、0.58、0.45。鈣超載組心房肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ表達(dá)較對照組明顯升高，KN93處理后，心房肌細(xì)胞CaMKⅡ表達(dá)下降，且隨KN93濃度的增加CaMKⅡ表達(dá)呈下降趨勢，KN93 1.0μmol/L組CaMKⅡ水平降至對照組水平(見表1)。

圖3 Western blotting檢測心房肌細(xì)胞中CaMKⅡ蛋白1.對照組;2.鈣超載組;3.KN93組(0.25μmol/L);4.KN93組(0.5μmol/L);5.KN93組(1.0μmol/L)Fig.3 Western bloting analysis of CaMKⅡprotein in atrial myocardium1.Control group;2.calcium overload group;3.KN93 group(0.25μmol/L);4.KN93 group(0.5μmol/L)

表1 不同組間心房肌細(xì)胞內(nèi)CaMKII比較Tabl.1 Comparison of CaMKII in atrial muscle cells within different groups

3 討論

房顫發(fā)生時(shí)心房肌細(xì)胞膜L型鈣離子通道電流密度下調(diào)是導(dǎo)致心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程、有效不應(yīng)期縮短以及傳導(dǎo)速度減慢等電生理學(xué)特性改變的分子基礎(chǔ)［6－7］。而心房肌細(xì)胞內(nèi)游離［Ca2+］的平衡即取決于細(xì)胞膜上L型鈣離子通道的調(diào)節(jié)作用。Ca2+的細(xì)胞學(xué)功能主要通過鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和其重要的下游信號分子功能來決定［8］。研究顯示，房顫的持續(xù)時(shí)間與CaM蛋白含量呈正相關(guān)，提示房顫時(shí)的鈣調(diào)控異常是導(dǎo)致房顫發(fā)生和維持的重要機(jī)制。鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(Calcium/calmodulin dependent protein kinase，CaMK)是一種廣泛存在于機(jī)體組織中的多功能蛋白激酶，其中亞型II，即CaMKII在心肌細(xì)胞中最為豐富，參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平調(diào)節(jié)，對心臟肌細(xì)胞的機(jī)械收縮，電活動(dòng)及基因轉(zhuǎn)錄等均發(fā)揮著潛在的調(diào)節(jié)作用［9］。即往研究結(jié)果表明，在房顫動(dòng)物模型及房顫患者中均發(fā)現(xiàn)心房肌細(xì)胞內(nèi)存在鈣代謝紊亂現(xiàn)象［10］，而CaMKII活性的增高可以導(dǎo)致心肌收縮力下降及細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加。由此，有學(xué)者推測心房肌細(xì)胞CaMKII的活化可能與心房纖顫的發(fā)生密切相關(guān)。新近研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，從慢性房顫患者分離的心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)存在鈣超載，而Ca2+/CaMKII信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是其重要的病理生理基礎(chǔ)［11－12］，而CaMKII抑制劑被發(fā)現(xiàn)可抑制由電場刺激誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞的增殖［13］，因此推測CaMKII抑制劑可能對心房肌纖維化的發(fā)生起阻滯作用。

本研究以心肌細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+和平均鈣瞬變幅度作為主要的評價(jià)指標(biāo)，探討 CaMKII抑制劑KN93對心肌細(xì)胞Ca2+超載的影響。結(jié)果顯示，KN93可下調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)游離［Ca2+］i，且不同濃度的KN93對鈣負(fù)荷的抑制程度有劑量依賴性，說明KN93在一定程度上可抑制心房肌細(xì)胞鈣超載。KN93是一種高效的CaMKII特異性抑制劑，它通過與CaM結(jié)合位點(diǎn)的相互作用［14］，使CaM與CaMKⅡ的結(jié)合受到阻滯，抑制了CaMKⅡ的自身磷酸化活性。因此推測KN93對心房肌細(xì)胞鈣超載的抑制作用主要是通過降低CaMKⅡ的自身磷酸化活性而實(shí)現(xiàn)的。

另外，除鈣離子通道異常與房顫有關(guān)外，肌漿網(wǎng)對鈣離子的釋放異常也是房顫發(fā)生的原因［15］，而CaMKⅡ的系統(tǒng)性抑制則是其靶向的另一選擇途徑。因此，CaMKⅡ抑制劑是否通過下調(diào)肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放則需進(jìn)一步研究。

綜上所述，CaMKⅡ抑制劑可在一定程度上抑制心房肌細(xì)胞鈣超載，其是否還存在其它的干預(yù)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，但可以明確的是，通過CaMKⅡ抑制劑的開發(fā)，可能會提供心房纖顫這一病理生理過程的靶向治療機(jī)會，從而進(jìn)行有效的抗心律失常藥物開發(fā)。

［1］周自強(qiáng)，胡大一，陳捷.“中國心房顫動(dòng)流行病學(xué)研究”結(jié)果解讀［J］.中華內(nèi)科雜志，2010，49(3):198-199.

［2］李耀東，湯寶鵬.鈣離子通道與老齡心房顫動(dòng)心房電重構(gòu)的研究進(jìn)展［J］. 心血管病學(xué)進(jìn)展，2011，32(5):718-720.

［3］趙晟，楊水祥.心臟電重構(gòu)的影響及意義進(jìn)展［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2013，7(19)，8874-8877.

［4］逯星竹，畢學(xué)苑，于曉江，等.鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ與心血管疾病的研究進(jìn)展［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，2014，45(1):32-36.

［5］秦瑤.CaMKⅡδ對心房肌細(xì)胞鈣離子流影響的研究［D］.第三軍醫(yī)大學(xué)，2011，5.

［6］Kato T，Iwasaki Y，Giordanetto F，etal.Does T-type Calcium Channel Blockade Protect against Atrial Fibrillation Related Remodeling?［C］//CIRCULATION.530 WALNUT ST，PHILADELPHIA，PA 19106-3621 USA:LIPPINCOTT WILLIAMS＆ WILKINS，2012，126(21).

［7］Chen WJ，Yeh YH，Lin KH，etal.Molecular characterization of thyroid hormone-inhibited atrial L-type calcium channel expression:implication for atrial fibrillation in hyperthyroidism［J］.Basic research in cardiology，2011，106(2):163-174.

［8］Nattel S，Dobrev D.The multidimensional role of calcium in atrial fibrillation pathophysiology:mechanistic insights and therapeutic opportunities［J］.European heart journal，2012，33(15):1870-1877.

［9］van Oort RJ，McCauley MD，Dixit SS，etal.Ryanodine receptor phosphorylation by calcium/calmodulin-dependent protein kinase II promotes life-threatening ventricular arrhythmias in mice with heart failure［J］.Circulation，2010，122(25):2669-2679.

［10］Yamashita T，Inoue H，Okumura K，etal.Randomized trial of angiotensin II-receptor blocker vs.dihydropiridine calcium channel blocker in the treatment of paroxysmal atrial fibrillation with hypertension(J-RHYTHM II study)［J］.Europace，2010，13(4):473-479.

［11］Neef S，Dybkova N，Sossalla S，etal.CaMKII-dependent diastolic SR Ca2+leak and elevated diastolic Ca2+levels in right atrial myocardium of patients with atrial fibrillation［J］.Circulation research，2010，106(6):1134-1144.

［12］Heijman J，Voigt N，Wehrens XHT，etal.Calcium dysregulation in atrial fibrillation:the role of CaMKII［J］.Frontiers in pharmacology，2014，4(5):30.

［13］鐘擁軍，陳東芹，姚小燕.CaMKⅡ抑制劑抑制AngⅡ或電場刺激誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞TNF-α，TGF-βcollagenⅠ，Ⅲ的表達(dá)［J］.中國病理生理雜志，2010，26(8):1549-1554.

［14］于倩，葛志強(qiáng).鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑的研究進(jìn)展［J］.中國生化藥物雜志，2007，28(3):210-212.

［15］梁峰，胡大一，沈珠軍.心房顫動(dòng)抗心律失常藥物研發(fā)的前景方向［J］.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013，7(14):6596-6599.