黃鑒，珠珠，陳昌望，李少，洪敏，董堅Δ

(1.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，云南 昆明 650032;2.恩施州中心醫(yī)院胃腸外科 湖北恩施 445000)

隨著人們生活環(huán)境的惡化及飲食習慣的改變，我國大腸癌的發(fā)病率逐年升高。大腸癌的發(fā)生與遺傳因素、飲食因素及相關疾病等關系密切［1］。目前治療大腸癌方法主要是手術為主的綜合治療［2］，大部分大腸癌患者在臨床診斷時已屬Ⅳ期，單純手術治療往往易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此化療對治療大腸癌有重要意義［3］。奧沙利鉑是目前治療大腸癌的第三代鉑類衍生物，其具有抑制腫瘤細胞增殖及促進細胞凋亡的作用，但是有嚴重的神經(jīng)毒性，臨床上應盡量減少奧沙利鉑的給藥量［4］。大蒜素又名大蒜新素，具有多種生物活性，最近幾年發(fā)現(xiàn)大蒜素還具抗腫瘤作用［5］，且其是從食物大蒜球莖中分離出的天然化合物，其毒性遠遠小于合成化療藥物［6］。本實驗旨在研究大蒜素與奧沙利鉑聯(lián)合應用治療大腸癌的可行性及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人結(jié)腸癌HCT-8細胞(中國科學院上海細胞庫);大蒜素標準品(上?；鈱崢I(yè)有限公司生產(chǎn));奧沙利鉑標準品(上海谷研科技有限公司);DMSO二甲基亞砜(AR)購于國藥集團化學試劑有限公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶(碧云天生物技術研究所)，胚胎/小牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司);蘇木素染液、小鼠抗人Caspase-3單克隆抗體、SP染色試劑盒、DAB檢測試劑盒(上海研生實業(yè)有限公司生產(chǎn));凱基AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);SPEETRA MAX190酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Molecular Devices);Gallios流式細胞儀(美國貝克曼)

1.2 實驗方法

1.2.1 大蒜素和奧沙利鉑聯(lián)合對HCT-8細胞增殖的影響:參照MTT法，取處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的腫瘤細胞HCT-8，用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后，1 500 r/min離心5 min，將細胞重懸于完全培養(yǎng)基中，計數(shù)，調(diào)整其濃度為2×104個/mL，以100μL每孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，放置于相對濕度90%，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后將細胞分成4組。大蒜素組加入終濃度為9μg/mL的大蒜素，奧沙利鉑組加入終濃度為5μg/mL的奧沙利鉑，聯(lián)用組同時加入終濃度為9μg/mL的大蒜素和5μg/mL的奧沙利鉑(終濃度依據(jù)預試驗中大蒜素和奧沙利鉑對HCT-8細胞72h的1/2 IC50濃度設置)，陰性對照組加入終濃度為0.5%的DMSO，各組均設3個復孔。加入藥物72 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入5mg/mL的MTT試劑20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清，每孔加入DMSO 100μL，振蕩至結(jié)晶物充分溶解，置于全自動酶標儀上，測定各孔在波長570 nm處的吸光度值(A)，取復孔吸光度平均值進行比較。細胞增殖抑制率:抑制率(%)=(1-實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%。以金正均法考察2藥合用的協(xié)同作用，其公式為q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)。若0.85＜q＜1.15為2藥合用單純相加，若q＞1.15為有協(xié)同作用，若q＜0.85表示2藥合用有拮抗作用［3］。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡:用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)HCT-8細胞24 h，細胞生長同步化后常規(guī)培養(yǎng)。瓶底70%面積長滿細胞時進行分組，分組及處理同1.2.1，每組平行做5份，作用72 h后終止，0.25%胰酶消化，1 500 r/min離心5 min，PBS重懸2次，調(diào)整細胞濃度為1.5×106個/mL，取各組各管細胞懸液2mL用于細胞周期檢測。另取各組各管細胞懸液100μL于5mL流式管中，用于細胞凋亡檢測，加人5μL Annexin-V/PE，加入400μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，800 r/min離心5 min沉淀細胞，用孵育緩沖液洗1次。重懸后及時上流式細胞儀檢測凋亡細胞。取上述預留各組各管細胞懸液1.5mL置于流式管中，加入預冷的70%冰乙醇3mL，置于4℃冰箱過夜后1 000 r/min離心5 min，除去上層乙醇，PBS洗3次，細胞濃度稀釋為1×106個/mL。取100μL細胞懸液，加入RNase使終濃度為100 ug/mL，于37℃消化0.5 h，加人PI使終濃度為50 ug/mL，于4℃染色1 h。300目尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液，用流式細胞儀檢測細胞周期［4］。實驗重復3次。

1.2.3 免疫組化法檢測caspase-3的表達:取處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的腫瘤細胞HCT-8，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后，1 500 r/min離心5 min，將細胞重懸于完全培養(yǎng)基中，計數(shù)，調(diào)整其濃度為2×104個/mL，以1mL/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，放置于相對濕度90%、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后當細胞長滿瓶底70%時按“1.2.1”下分組并加入藥物。作用72 h后終止，棄除培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，每孔加4%多聚甲醛2mL，固定0.5 h。吸去甲醛，PBS漂洗3次，每次5 min。剩余步驟嚴格按照DAB試劑盒說明書操作，蘇木素復染色后于顯微鏡下觀察異常分裂細胞，約10 s細胞核變藍后自來水沖洗終止復染，實驗重復3次。結(jié)果判定:caspase-3陽性細胞胞漿/胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，以胞漿為主。異常分裂細胞主要指有絲分裂期兩個子代細胞的細胞核形態(tài)明顯不對稱或細胞核數(shù)目＞2個。在高倍鏡視野(×400)下。隨機選擇10個視野，每個視野計算100個細胞，然后計算陽性細胞百分率，對3次染色后的細胞陽性率計算均值。在高倍鏡視野(×400)下，隨機選擇500個細胞視野，計算視野中異常細胞數(shù)n，以n/500×100%表示異常分裂細胞占分裂期細胞的百分比，試驗重復3次，計算均值［5］。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS l5.0軟件分析，正態(tài)計量資料采用“±s”表示，組間比較采用t檢驗;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素和奧沙利鉑單用及聯(lián)合作用對HCT-8細胞增殖的影響 與單藥組比較，聯(lián)用組的細胞生長抑制率明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。依據(jù)金正均公式計算，q=1.34，說明2藥聯(lián)用具有協(xié)同作用(見圖1)。

圖1 大蒜素和奧沙利鉑作用72 h后對HCT-8細胞增殖的影響＊＊P＜0.01，與聯(lián)用組比較Fig.1 Effect of allicin and oxaliplatin on HCT-8 cell proliferation＊＊P＜0.01，compared with the combination group

2.2 大蒜素和奧沙利鉑單獨及聯(lián)合作用72 h后對細胞周期的影響 大蒜素和奧沙利鉑單獨及聯(lián)合作用72 h后，奧沙利鉑組各周期百分比與對照組比較無明顯變化。與對照組比較，大蒜素組和聯(lián)合用藥組的G0/Gl期細胞均明顯減少，G2/M期細胞均明顯增加(P＜0.01)，而S期細胞無明顯變化(見圖2、圖3)。

圖2 各處理組處理72 h后對HCT-8細胞周期的影響A:4組總細胞;B:以PE-A(相對熒光強度)/PE-W(PE通道的寬度)為橫縱坐標，P1門里的細胞為分析對象;C:對照組;D:大蒜素組;E:奧沙利鉑組;F:聯(lián)用組Fig.2 Effect of four treatment groups on HCT-8 cell cyclesA:the total cells in four groups;B:PE-A(relative fluorescence intensity)/PE-W(PE channel width)for the horizontal and vertical coordinates，select the P1 inside cells as the analysis object;C:control group;D:allicin group;E:oxaliplatin group;F:the group of combination

圖3 大蒜素和奧沙利鉑單獨及聯(lián)合作用72 h后對細胞周期的影響＊＊P＜0.01，與奧沙利鉑組比較;ΔΔP＜0.01，與大蒜素組比較;##P＜0.01，與對照組比較Fig.3 Effect of allicin and oxaliplatin on cell cycles＊＊P＜0.01，comparied with oxaliplatin group;ΔΔP＜0.01，compared with allicin group;##P＜0.01，compared with control group

2.3 大蒜素和奧沙利鉑單獨及聯(lián)合作用24 h后對細胞凋亡及caspase-3表達的影響 流式結(jié)果顯示:大蒜素組、奧沙利鉑組及聯(lián)合用藥組的凋亡率均明顯大于對照組(P＜0.01);與單獨組比較，聯(lián)合用藥組細胞凋亡率明顯增高(P＜0.01)。免疫細胞化學SP法結(jié)果顯示:大蒜素組、奧沙利鉑組及聯(lián)合用藥組的caspase-3的陽性表達率明顯高于對照組(P＜0.01);與奧沙利鉑組比較，大蒜素組的caspase-3陽性表達率差異無統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，聯(lián)用組的caspase-3陽性表達率顯著高于奧沙利鉑組及大蒜素組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，見圖4、圖5)。

圖5 大蒜素和奧沙利鉑單獨及聯(lián)合作用24 h后對HCT－8細胞凋亡及caspase-3表達的影響＊＊P＜0.01，與奧沙利鉑組比較;ΔΔP＜0.01，與大蒜素組比較;##P＜0.01，與對照組比較Fig.5 Effect of allicin and oxaliplatin on cell apoptosis caspase 3 expression after treatment with 24 h＊＊P＜0.01，comparied with oxaliplatin group;ΔΔP＜0.01，compared with allicin group;##P＜0.01，compared with control group

3 討論

奧沙利鉑具有阻斷DNA雙鏈復制和轉(zhuǎn)錄，誘導細胞凋亡的藥理作用，目前是大腸癌術后輔助化療的第三代鉑類衍生物，比前兩代鉑類衍生物具有更強的抗腫瘤作用［7-8］。但是奧沙利鉑的神經(jīng)毒性很強，且發(fā)生率高，因此臨床上應盡量減少奧沙利鉑的給藥劑量［9］。

大蒜素(allicin)又名大蒜新素，為無色油狀物，具有強烈蒜臭味，化學名二烯丙基三硫化物，結(jié)構式為CH2=CH-CH2-S-S-SCH2-CH=CH2［10］。大蒜素具有多種生物活性，如抗細菌、抗真菌、降血壓、降血醋、防治動脈粥樣硬化等。近年來發(fā)現(xiàn)大蒜素具有抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期、誘導凋亡及調(diào)節(jié)化療敏感性等抗腫瘤作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)，常食蒜類可降低腸道腫瘤的發(fā)生率，國內(nèi)外亦有報道大蒜素聯(lián)合順鉑或紫杉醇作用于前列腺癌、宮頸癌、食管癌及胃癌等細胞，且療效顯著［12］。因此本文考慮將大蒜素與奧沙利鉑聯(lián)合作用于大腸癌，一方面減少奧沙利鉑的給藥劑量及臨床毒性，另一方面提高奧沙利鉑的抗腫瘤療效，減少對大腸癌的耐藥性。

本文考察了大蒜素與奧沙利鉑聯(lián)合應用對大腸癌細胞增殖和凋亡的影響。Gunjan Tyagi等［13］報道大蒜素作用于肺癌A549細胞72 h后的IC50值約為30 ug/mL，本文預實驗中大蒜素對HCT-8細胞的IC50值約為18 ug/mL，說明大蒜素對HCT-8細胞的抑制增殖敏感性強于A549細胞。本文研究發(fā)現(xiàn)，單用終濃度為9μg/mL的大蒜素和5μg/mL的奧沙利鉑作用于HCT-8細胞72 h后的生長抑制率分別為(32.13±1.87)%和(31.11±2.73)%，聯(lián)用組作用于HCT-8細胞72 h后生長抑制率為(71.18±3.68)%，通過金正均公式計算，說明2者具有協(xié)同作用。關于2者協(xié)同抑制HCT-8細胞增殖的作用機制尚需進一步研究。

關于大蒜素影響細胞周期的研究已有多篇文獻報道［14-15］。本文研究發(fā)現(xiàn)，各給藥組處理后，奧沙利鉑組各周期百分比與對照組比較無明顯變化。與對照組比較，大蒜素組和聯(lián)合用藥組的G0/Gl期細胞均明顯減少，G2/M期細胞均明顯增加(P＜0.01)，而S期細胞無明顯變化。因此大蒜素能將HCT-8細胞周期阻滯于G2/M期，而奧沙利鉑對細胞周期沒有影響。Gunjan Tyagi等［16］研究結(jié)果顯示:大蒜素能與DNA、tRNA上堿基結(jié)合從而破壞DNA的合成和tRNA的表達，而G2/M期調(diào)控點是細胞周期的監(jiān)控機制，能防止受損的DNA和未完成復制的DNA進入有絲分裂。因此，HCT2-8細胞周期阻滯于G2/M期的作用機制可能與細胞核內(nèi)DNA和tRNA上堿基結(jié)合有關［17-18］。奧沙利鉑也能與DNA形成復合物，阻斷DNA雙鏈的復制和轉(zhuǎn)錄，進而誘導細胞凋亡［19］。大蒜素與奧沙利鉑協(xié)同抑制HCT-8細胞增殖的作用機制可能與共同作用于DNA的復制和轉(zhuǎn)錄有關。

本文還對大蒜素與奧沙利鉑聯(lián)用對HCT-8細胞凋亡進行了分析，結(jié)果顯示:與單獨組比較，聯(lián)合用藥組細胞凋亡率明顯增高(P＜0.01)。caspase-3表達情況結(jié)果顯示:大蒜素組、奧沙利鉑組及聯(lián)合用藥組的caspase-3的陽性表達率明顯高于對照組(P＜0.01);與奧沙利鉑組比較，大蒜素組的caspase-3陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，聯(lián)用組的caspase-3陽性表達率顯著高于奧沙利鉑組及大蒜素組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。因此，大蒜素與奧沙利鉑聯(lián)用促進HCT-8細胞凋亡可能與誘導caspase-3陽性表達有關。

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