李文君，徐振田，索大琴，謝安智

(廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 廈門 361000)

免疫性炎癥反應(yīng)參與了缺血性中風(fēng)后的腦損傷。腦缺血后數(shù)小時(shí)，受損腦區(qū)域的炎癥反應(yīng)開始啟動(dòng)，持續(xù)數(shù)天后，使腦缺血所致的遲發(fā)性腦損傷加重。腦缺血后釋放大量自由基、炎癥因子和前炎癥物質(zhì)，損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促使神經(jīng)細(xì)胞死亡，加重缺血性中風(fēng)的損傷，因此腦缺血損傷中的炎癥反應(yīng)越來越受到關(guān)注［1-3］。天麻(Gastrodia rhizome)為蘭科植物的干燥塊莖，其有效成分天麻素(Gastrodine)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有較廣泛的藥理活性，能擴(kuò)張腦血管、增加腦血流量、提高腦細(xì)胞抗缺氧能力［4-5］。天麻素是否影響腦缺血再灌注損傷血腦屏障的通透性，是否影響到缺血半暗帶的炎癥反應(yīng)，目前尚未見報(bào)道。

本研究在大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷模型基礎(chǔ)上，通過測定天麻素對梗死半暗帶皮層組織內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)的影響，旨在深入研究天麻素對腦缺血過程中炎癥反應(yīng)的作用，為臨床治療腦缺血提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 天麻素(Gas)，上海永葉生物科技有限公司;兔抗鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6抗體，Abcam 公司，兔抗鼠β-actin單克隆抗體，Santa Cruz公司;ECL發(fā)光系統(tǒng)，聯(lián)科生物公司;2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC)，美國 Amresco公司;其它均為市售分析純產(chǎn)品。

顯微手術(shù)器械，上海醫(yī)療器械有限公司;多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司;Western blot裝置，美國BioRad公司;Kodak IS4000R全自動(dòng)圖像工作站，美國Kodak公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠120只，雄性，體質(zhì)量250～300 g，由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SYXK(閩)2013－0003。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。

1.3 方法

1.3.1 大鼠大腦中脈栓塞腦缺血模型的制備:線拴法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞模型(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)［6］。大鼠稱重、麻醉;分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈;用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處剪一小口，將線栓經(jīng)切口處插入大腦中動(dòng)脈始端，栓塞大腦中動(dòng)脈，造成局灶性腦缺血，缺血2 h后拔出線栓，即形成再灌注，動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)對側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙即為模型制備成功。

1.3.2 分組及給藥:為評(píng)價(jià)Gas對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響，50只SD大鼠隨機(jī)分為5組:①假手術(shù)組(Sham組):僅手術(shù)暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，不做缺血處理;②溶媒組(Model組):造模后缺血2 h后再灌注;③～⑤Gas給藥組(5、10、20mg/kg組):腦缺血再灌注同時(shí)分別給予Gas 5、10、20mg/kg腹腔注射。

1.3.3 免疫印跡:為檢測Gas對大鼠腦缺血后梗死半暗帶炎癥因子的作用，在腦缺血后24 h處死大鼠，取梗死半暗帶皮層組織，加入裂解液冰上裂解30 min后，14 000 r/min離心10 min，上清即為總組織蛋白溶解成分。SDS-PAGE每孔上樣量為50 ug，蛋白經(jīng)電泳分離后，將膠上蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，然后分別加入1∶1000稀釋的兔抗大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6多克隆抗體，4℃孵育過夜，再加入1∶5 000稀釋的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，用化學(xué)熒光試劑檢測，使用Kodak IS4000R系統(tǒng)檢測成像分析。實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.3.4 腦損傷的評(píng)價(jià)

①神經(jīng)功能缺失評(píng)分:大鼠腦缺血后再灌注24 h參照Longer 5分法［7］進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分。

②腦梗死灶體積及腦水腫的測定:大鼠腦缺血后再灌注2 h，斷頭取腦，于－20℃中冷凍30 min，切成2.0 mm厚的冠狀切片，放于1%TTC溶液中，避光37℃恒溫孵育20 min，4%多聚甲醛溶液中避光固定24 h后，運(yùn)用圖像分析處理軟件計(jì)算腦梗死體積。

③血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞程度的觀察和測定:大鼠腦缺血后再灌注6 h，尾靜脈注射質(zhì)量濃度為5%的伊文思藍(lán)(evansblue，EB)，劑量 10mL/kg，18 h 后，給予水合氯醛麻醉后打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導(dǎo)管至主動(dòng)脈，向主動(dòng)脈內(nèi)緩慢注入生理鹽水，直到右心房流出液體變清亮，斷頭取腦，整腦拍照后，于－20℃中冷凍15 min，切成2.0 mm厚的冠狀切片。未受損的正常腦組織無EB滲透呈白色;梗死側(cè)腦組織有大量EB滲透呈藍(lán)色，說明血腦屏障受損。用相機(jī)按順序拍攝染色后的腦片，用圖像分析與處理軟件計(jì)算每個(gè)腦片EB滲透面積，EB滲透體積為:面積求和后乘以切片厚度(2 mm)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，組間比較做單因素方差分析，兩兩比較選用LSD-t法分析。

2 結(jié)果

2.1 Gas對大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用 大鼠腦缺血再灌注后24 h，損傷側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯的蒼白梗死灶，Gas 10，20mg/kg再灌注同時(shí)給藥可劑量依賴性減小腦梗死體積，Gas 5mg/kg無效(圖1a，1b)。大鼠腦缺血再灌后24 h，出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷，與Sham組相比，神經(jīng)功能缺失評(píng)分明顯升高;Gas給藥組(10、20mg/kg)可減少神經(jīng)功能缺失評(píng)分，并呈劑量依賴性，Gas 5mg/kg組無影響(見圖1c)。

圖1 Gas對大鼠腦缺血的保護(hù)作用##P＜0.01，與Sham 組相比;*P＜0.05，＊＊P＜0.01，與Model組相比Fig.1 Protection effect of Gas on cerebral ischemia rats##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with Model group

2.2 Gas對大鼠腦缺血后BBB通透性的影響 通過EB滲漏法觀察腦缺血再灌注后大鼠BBB通透性的變化，表明腦缺血再灌注后24 h，腦內(nèi) EB滲漏量明顯增大(見圖2a)。Gas(20mg/kg)再灌后給藥后EB的滲漏體積與Model組相比明顯減少(P＜0.05)，表明Gas(20mg/kg)可減少EB在腦內(nèi)的滲漏，減輕腦缺血再灌注后BBB的破壞程度(見圖2b)。

圖2 Gas對大鼠腦缺血后BBB通透性的影響##P＜0.01，與Sham組相比;*P＜0.05，與Model組相比Fig.2 Effect of Gas on BBB disruption in brain ischemia rats##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

2.3 Gas(20mg/kg)對腦缺血后大鼠皮層梗死半暗帶TNF-α蛋白表達(dá)的影響 大鼠腦缺血再灌注24 h，皮層梗死半暗帶TNF-α蛋白表達(dá)明顯增加，Gas(20mg/kg)腦缺血再灌注同時(shí)給藥可降低梗死半暗帶TNF-α蛋白表達(dá)，抑制率為24%(見圖3)。

圖3 Gas對大鼠腦缺血梗死半暗帶皮層組織TNF-α蛋白表達(dá)的影響##P＜0.01，與Sham組相比;*P＜0.05，與Model組相比Fig.3 Effect of Gas(20mg/kg)on TNF-αexpression in penumbra of cortex tissue after cerebral ischemia##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

2.4 Gas(20mg/kg)對腦缺血后大鼠皮層梗死半暗帶IL-1β蛋白表達(dá)的影響 大鼠腦缺血再灌注后24 h，皮層梗死半暗帶IL-1β蛋白表達(dá)明顯增加，Gas(20mg/kg)腦缺血再灌注同時(shí)給藥可降低梗死半暗帶IL-1β蛋白表達(dá)，抑制率為34%(見圖4)。

圖4 Gas(20mg/kg)對大鼠腦缺血梗死半暗帶皮層組織IL-1β的表達(dá)的影響##P＜0.01，與Sham組相比;*P＜0.05，與Model組相比Fig.4 Effect of Gas(20mg/kg)on IL-1βexpression in penumbra ofcortex tissue after cerebral ischemia##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

2.5 Gas(20mg/kg)對腦缺血后大鼠皮層梗死半暗帶IL-6蛋白表達(dá)的影響 大鼠腦缺血再灌注后24 h，皮層梗死半暗帶IL-6蛋白表達(dá)明顯增加，Gas(20mg/kg)腦缺血再灌注同時(shí)給藥可降低梗死半暗帶IL-6蛋白表達(dá)，抑制率為38%(見圖5)。

圖5 Gas(20mg/kg)對大鼠腦缺血梗死半暗帶皮層組織IL-6的表達(dá)的影響##P＜0.01，與Sham組相比;*P＜0.05，與Model組相比Fig.5 Effect of Gas(20mg/kg)on IL-6 expression in penumbra of cortex tissue after cerebral ischemia##P＜0.01，compared with Sham group;*P＜0.05，compared with Model group

3 討論

腦血管疾病是繼惡性腫瘤和心血管疾病之后，威脅人類生存與健康的第三大疾病，因具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)，給社會(huì)家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，其中缺血性腦血管病占全部腦血管病的80%［7］。隨著我國老齡化趨勢增強(qiáng)，缺血性腦血管疾病患者人數(shù)急劇上升。因此，尋找腦缺血保護(hù)作用的藥物意義重大。

天麻素是天麻的有效成分。以往研究表明天麻素可不同程度地增加腦血流量，降低血管阻力，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡［8-9］，改善老齡大鼠的學(xué)習(xí)記憶等功能［10］。BBB是存在于血液和腦組織之間的一道屏障，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用EB為示蹤劑，觀察腦缺血再灌注后腦內(nèi)BBB通透性的變化，選取EB在腦內(nèi)滲漏最明顯的時(shí)間即再灌注6 h作為觀察藥物作用的時(shí)間點(diǎn)［11］。腦缺血再灌注會(huì)破壞BBB完整性，導(dǎo)致血液中的成分滲入腦組織，形成血管源性腦水腫，進(jìn)一步加重腦損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:腦缺血再灌注同時(shí)給藥Gas(20mg/kg，i.p)可明顯減少EB在腦內(nèi)的滲漏，說明Gas對腦缺血/再灌注后的BBB具有保護(hù)作用，其通過保護(hù)BBB的完整性減輕腦缺血再灌注損傷。此外，本研究還表明Gas在改善BBB的同時(shí)可減少腦梗死體積及改善神經(jīng)功能缺失。

炎癥反應(yīng)是造成腦卒中后繼發(fā)性損傷的主要因素之一［12-13］，腦缺血后再灌注損傷可激活大量炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，加重局部腦組織損傷。如何抑制炎性因子釋放，是減輕缺血性腦損傷中一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。TNF-α是一種在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中很重要的細(xì)胞因子，其在腦缺血早期生成的增加是腦梗塞形成的主要原因［14］。IL-6對于多種細(xì)胞的生長、分化與調(diào)控都有影響，其過度表達(dá)與缺血性腦損傷密切相關(guān)。缺血再灌注大鼠與臨床卒中患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)均會(huì)產(chǎn)生IL-6，其表達(dá)水平的高低是評(píng)價(jià)缺血再灌注損傷程度的一個(gè)重要指標(biāo)［15］。本研究通過建立大鼠腦缺血/再灌注模型，證實(shí)了Gas可減輕腦缺血神經(jīng)功能損傷和降低腦梗死體積，且具有劑量依賴性，Gas 20mg/kg的保護(hù)作用更為明顯。為了進(jìn)一步研究Gas腦保護(hù)的作用機(jī)制，檢測了TNFα、IL-1β和IL-6在梗死半暗帶皮層組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示腦缺血后半暗帶TNFα、IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)明顯升高，而Gas 20mg/kg可抑制TNFα、IL-1β和IL-6的表達(dá)。說明Gas也可通過減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步減輕缺血性腦損傷。

本研究結(jié)果表明Gas對大鼠腦缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。通過抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，改善血腦屏障的完整性可能是Gas保護(hù)缺血性腦損傷的機(jī)制。

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