竇孝康

(黔西南州人民醫(yī)院 普外燒傷科，貴州 興義 562400)

瘢痕是因物理、生物、化學等因素的作用導致皮膚軟組織損傷而不能完全自行正常修復，轉(zhuǎn)由纖維組織替代修復遺留的病理狀態(tài)。適度的瘢痕形成是一種生理性和自衛(wèi)性表現(xiàn)，而過度增生則屬于病理狀況。瘢痕組織的生成包括3個步驟:①肉芽組織形成將創(chuàng)腔填滿，創(chuàng)面鋪墊平整。②創(chuàng)緣的向心性收縮，牽拉四周正常皮膚向內(nèi)移動使邊緣互相接近。③上皮再生，源于創(chuàng)面的皮膚表皮的新生上皮細胞向創(chuàng)面中心聚攏推進，逐漸覆蓋肉芽組織，形成皮膚瘢痕，創(chuàng)面最終愈合。從病理學角度可將瘢痕分為3類:正常皮膚瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。后2者均屬于病理性增生，其發(fā)生機制至今仍不明確，因此難以有效治療。目前的治療方式有通過加壓、藥物、放射、激光、冷凍、中醫(yī)藥手術等，但沒有一種方法能完全地避免或消除瘢痕。

近年來由于細胞生物學和分子生物學的發(fā)展，對瘢痕的研究取得了一定進展，尤其是一些與瘢痕相關的生長因子及信號傳導通路的發(fā)現(xiàn)，為治療瘢痕提供了新的思路。在眾多細胞因子中，TGFβ因與瘢痕增生關系密切，一直是研究的熱點之一。本研究旨在通過構建兔耳瘢痕模型，采用雌三醇作為瘢痕增生的促進劑并以三苯氧胺作為拮抗劑，通過大體標本的觀察、HE染色及免疫組化方法，觀察其對兔耳瘢痕模型的影響，探索雌三醇與瘢痕增生、三苯氧胺抑制瘢痕增生的關系，以及對TGF-β1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大耳兔24只，體質(zhì)量為2.2～2.8 kg，兔齡在2～4月，均為雌性，分籠人工飼料飼養(yǎng)。本實驗嚴格遵循《實驗動物管理條例》。實驗動物由貴陽中醫(yī)學學院實驗動物中心提供(動物合格證號2001A032)。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔瘢痕模型構建:將大耳兔隨機分成3組:雌三醇組、三苯氧胺組、對照組。每只兔耳制作6個直徑1.2 cm圓形標記，間隔約1 cm。24只兔子共制作288個創(chuàng)面。2周后，兔耳打孔處出現(xiàn)圓形瘢痕，為兔瘢痕模型構建成功。

1.2.2 實驗給藥:雌三醇組用雌三醇乳膏(默沙東制藥有限公司，國藥準字H20091091)外涂。涂抹劑量為每孔為0.0015mg，每天1次;三苯氧胺組除用以同樣劑量雌三醇乳膏外涂外加用三苯氧胺(楊子江制藥公司，國藥準字H32021472)，10mg/d喂服;對照組未用藥。

1.3 實驗指標采集

1.3.1 各組標本中瘢痕形態(tài):麻醉后切取每只兔左耳外側(cè)近耳尖部第一個瘢痕組織以4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。觀察并拍照，對比實驗組和對照組瘢痕的表面、質(zhì)地、厚度、色澤及是否有皮釘存在。

1.3.2 瘢痕指數(shù)的測定:將HE染色石蠟切片放置于光鏡下，在100倍鏡下用計算機圖像分析系統(tǒng)測量創(chuàng)面上皮化后的真皮厚度和鄰近正常組織的真皮厚度，計算瘢痕指數(shù)，按照下列公式［2］。

1.3.3 免疫組化結(jié)果分析:瘢痕組織中含大量TGF-β1，在成纖維細胞細胞質(zhì)或細胞膜中呈現(xiàn)棕黃色或紅褐色為陽性表達。選用染色細胞數(shù)及染色強度綜合評分方法(IHS法)［3］進行統(tǒng)計評分。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0分析處理數(shù)據(jù)，正態(tài)計量資料用“±s”表達，其中兩兩間均數(shù)比較采用配對t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兔瘢痕模型建立 24只兔子共制作288個創(chuàng)面(圖1左)。2周后，所有創(chuàng)面均愈合，上皮化完成，兔耳打孔處出現(xiàn)了圓形瘢痕，288處創(chuàng)面均出現(xiàn)瘢痕，無流膿流液(圖1右)。

圖1 兔瘢痕模型構建Fig.1 Construction of rabbit hypertrophic scars model

2.2 術后2周標本中呈現(xiàn)的瘢痕增生情況

2.2.1 大體標本:2周后觀察3組瘢痕大體標本，雌激素組瘢痕稍高出皮膚表面，質(zhì)地中，色澤偏紅;苯氧胺組、對照組瘢痕情況同雌激素組(見圖2)。3組的表面、質(zhì)地、色澤、厚度、直徑及皮釘數(shù)目無明顯差異(見表1)。

圖2 3組瘢痕增生情況比較Fig.2 Comparasion of scar hyperplasia among three groups

表1 3組瘢痕大體標本表現(xiàn)Tab.1 Performance of scar gross in three groups

2.2.2 術后2周3組瘢痕指數(shù)測定結(jié)果:雌激素組測量的瘢痕指數(shù)為1.55±0.34;三苯氧胺組測量的瘢痕指數(shù)為1.66±0.18，空白對照組測量的瘢痕指數(shù)為1.49±0.25。3組瘢痕指數(shù)兩兩比較均無顯著性差異。

2.2.3 術后2周3組瘢痕組織光鏡下HE染色結(jié)果:光鏡結(jié)果顯示:3組均有成纖維細胞增生，膠原纖維沉積，并可見淋巴細胞、槳細胞以及中性細胞浸潤，比較無顯著性差異(見圖3)。

圖3 術后2周3組瘢痕組織光鏡下HE染色結(jié)果(×400)Fig.3 HE staining results of scar tissue in three groups posrview at 2 weeks(×400)

2.2.4 3組瘢痕組織免疫組化檢測結(jié)果:TGF-β1主要在成纖維細胞細胞質(zhì)中表達，雌激素組、三苯氧胺組及對照組的TGF-β1在兔耳瘢痕中均多呈低表達反應，強陽性表達很少(見圖4)。TGF-β1在各組瘢痕中的強陽性表達及積分情況見表2。

圖4 3組瘢痕組織TGF-β1免疫組化檢測結(jié)果Fig.4 Immunohistochemical detection results of TGF-beta 1 in scar tissues of three groups

表2 二周時TGF-β1在各組瘢痕中的強陽性表達情況以及IHS在各組的積分Tab.2 Strong positive expression of TGF-β1 and the integral IHS in each group after two weeks

2.3 術后5周3組標本中呈現(xiàn)的瘢痕增生情況

2.3.1 術后5周3組瘢痕大體情況:雌激素組可見瘢痕明顯高出于皮膚表面，增生比較明顯，表現(xiàn)為質(zhì)地較硬，色澤偏紅，大部分創(chuàng)面中央?yún)^(qū)出現(xiàn)較大皮釘，而三苯氧胺組瘢痕與皮膚表面相平，增生不明顯，表現(xiàn)為質(zhì)地軟，色澤偏淡，皮釘數(shù)目少而且較小，對照組瘢痕與三苯氧胺組類似(見圖5)。瘢痕大體表現(xiàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計見表3。

圖5 術后5周3組瘢痕大體情況Fig.5 General situation of scar in three groups posrview at 5 weeks

表3 瘢痕大體表現(xiàn)統(tǒng)計表Tab.3 Performance of scar gross in three groups

2.3.2 術后5周瘢痕指數(shù)的測定:雌激素組瘢痕明顯高過周圍皮膚表面，瘢痕指數(shù)為2.25±0.34;三苯氧胺組瘢痕較為扁平，瘢痕指數(shù)為1.64±0.25;空白對照組瘢痕也呈現(xiàn)為扁平瘢痕表現(xiàn)，瘢痕指數(shù)為1.09±0.18。雌激素組瘢痕指數(shù)顯著高于空白對照組(P＜0.05)。三苯氧胺瘢痕指數(shù)顯著低于雌激素組(P＜0.05)。

2.3.3 術后5周3組瘢痕組織HE染色結(jié)果:雌激素組瘢痕組織中膠原纖維增多，排列雜亂，血管數(shù)目增多，成纖維細胞大量增多，淋巴細胞、漿細胞以及中性白細胞增多。三苯氧胺組瘢痕組織中膠原纖維減少，成纖維細胞較少，血管數(shù)目少，排列整齊，淋巴細胞、漿細胞以及中性白細胞減少。對照組介于2者之間(見圖6)。

圖6 術后5周3組瘢痕組織HE染色結(jié)果(×400)Fig.6 HE staining results of scar tissues in three groups posrview at 5 weeks(×400)

2.3.4 術后5周3組瘢痕組織免疫組化結(jié)果:雌激素組TGF-β1在兔耳瘢痕中呈高表達，在三苯氧胺組及對照組中均呈低表達(見圖7)。TGF-β1在各組瘢痕中的陽性表達情況及程度見表4。

圖7 術后5周3組瘢痕組織免疫組化結(jié)果Fig.7 Immunohistochemical results of scar tissues in three groups posrview at 5 weeks

表4 5周時TGF-β1在各組瘢痕中的強陽性表達情況以及IHS在各組的積分Tab.4 Strong positive expression of TGF-β1 and the integral IHS in each group after 5 weeks

3 討論

由本實驗結(jié)果可知:雌三醇乳膏對兔耳瘢痕有促進增生的作用，并與TGF-β1表達同步。三苯氧胺可以抑制雌三醇引起的兔耳瘢痕增生。三苯氧胺組與對照組比較，除TGF-β1表達明顯少于對照組外，2組其他結(jié)果均接近，是否三苯氧胺除阻止雌激素刺激瘢痕增生外還有其他抑制瘢痕增生的機制呢?目前尚不能下定論。雌三醇對兔耳增生性瘢痕模型的建立與改進有重要意義。

雌激素屬脂溶性激素，可以透過細胞膜，經(jīng)細胞質(zhì)、再經(jīng)過核膜而進入核內(nèi)，以核蛋白作為受體，直接在染色質(zhì)上改變受體的構象而發(fā)揮作用［4-5］。雌激素對子宮內(nèi)膜和平滑肌的代謝有明顯促進作用。刺激陰道上皮基底層細胞增生、分化、成熟以及角化和引起核致密變化，刺激人類乳腺導管的生長和乳腺腺泡的發(fā)育［6-7］。

三苯氧胺在兔耳瘢痕增生中主要表現(xiàn)為抑制作用，它可以抑制成纖維細胞的增殖，并且還能抑制膠原的沉積。李兵等［8］和胡大海等［9］報告顯示三苯氧胺還可以抑制瘢痕成纖維細胞DNA及膠原的合成。本實驗中，三苯氧胺組對瘢痕也同樣表現(xiàn)出抑制作用，大體標本表現(xiàn)為瘢痕厚度變薄、質(zhì)地變軟、色澤偏暗、皮釘數(shù)目較少;光鏡下表現(xiàn)為成纖維細胞數(shù)目較雌激素少，膠原沉積少;免疫組化結(jié)果顯示TGF-β1呈現(xiàn)低表達，IHS積分較對照組低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

在哺乳動物機體內(nèi)，有多種細胞分泌非活性狀態(tài)的TGF-β，非活性狀態(tài)的TGF-β通過酸化可被活化。在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了3 種亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1、TGF-β2與瘢痕增生有密切關系。TGF-β1能夠加速成纖維細胞增殖，刺激膠原等胞外基質(zhì)的沉積，趨化巨噬細胞向傷口聚集，誘導肉芽組織的生長，在促進創(chuàng)面修復以及修復后組織改建過程中起重要作用。從本次免疫組化結(jié)果可見:TGF-β1在雌三醇組的表達明顯高于三苯氧胺組及對照組，呈現(xiàn)高表達反應，表現(xiàn)在成纖維細胞的細胞質(zhì)中呈現(xiàn)為多量、成片的棕黃色，并能見到大量的膠原沉積，說明雌激素導致的瘢痕增生與TGF-β1有關。而在三苯氧胺組TGF-β1呈現(xiàn)低表達反應，在成纖維細胞分布區(qū)域表現(xiàn)為少量，小片狀棕黃色，且膠原沉積較少，說明TGF-β1減少與瘢痕抑制有一定的相關性。

除此之外，兔耳瘢痕模型制作對于研究瘢痕形成、發(fā)展、增生有重要意義，雖已有許多研究，但目前仍以兔耳瘢痕模型為佳，本實驗可見局部使用雌三醇乳膏可導致明顯的增生現(xiàn)象，而三苯氧胺能抑制雌激素引起的兔耳瘢痕增生。然而是否可將在局部使用雌激素作為制作增生性瘢痕模型的方法是值得商榷的。本實驗不足在于樣本例數(shù)少、時間短，檢測指標較簡單，進一步結(jié)論還有待后續(xù)研究。

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